蛋白质组学

分离纯化常用的高效液相色谱法都有什么类型?

高效液相色谱现在是分析化学的工具之一。它具有分离,鉴定和定量存在于可溶于液体的样品中的化合物的能力。如今,容易发现痕量浓度低至万亿分之一(ppt)的化合物。HPLC可以并且已经应用于多种样品,例如药品,食品,营养食品,化妆品,环境基质,法医样品和工业化学品,也是研究的基本工具。

高效液相色谱法的历史

1970年, CsabaHorváth教授在其Pittcon论文中创造了首字母缩写“HPLC”,表明了使用高压来产生填充色谱柱中液相色谱所需的流量这一事实。最开始泵的压力承受能力仅为500 psi(35 bar),被称为高压液相色谱或HPLC。1970年代初,技术取得了一定成就。这些新的HPLC仪器可产生高达6,000 psi(400 bar)的压力,并装有改进的进样器,检测器和色谱柱。在1970年代中期至后期HPLC开始流行。在这段时间中HPLC技术不断进步(较小的颗粒,甚至更高的压力)。其首字母缩写“HPLC”在该技术的发展中保持不变,但其名称变更为高效液相色谱法。

高效液相色谱法的类型

目前常用的高效液相色谱有以下几种类型:亲和色谱、体积排阻色谱法、化学键合相色谱法和吸附色谱法。下面我们将对以上几种分离类型进行简单介绍。

亲和色谱法

当溶剂(或流动相)中的溶质穿过基质(或固定相)的外部或周围时,溶质与固定相之间会发生相互作用。根据这些相互作用的差异,分离具有不同特性的溶质。

 亲和层析法的原理

图1 亲和层析法的原理 (Hermanson et al, 2013).

体积排阻色谱

体积排阻色谱法是HPLC分离模式之一。所用的色谱柱填充有包含许多孔的物质。当各种大小的溶解分子流入色谱柱时,较小的溶解分子会通过色谱柱深处进入孔中,因此流过色谱柱的速度会更慢,而较大的溶解分子则由于它们不会进入孔中而迅速流过色谱柱。因此,较大的分子较早从色谱柱上洗脱下来,较小的分子较晚从色谱柱上洗脱下来,从而有效地按大小对分子进行了分类。

 体积排阻色谱法原理

图2 体积排阻色谱法原理(Wolf et al, 2015)

体积排阻色谱法有两种基本类型。一种是凝胶渗透色谱(GPC),它使用疏水柱填充材料和非水流动相(有机溶剂)来测量合成聚合物的分子量分布。另一种是凝胶过滤色谱法(GFC),它使用亲水性填充材料和水性流动相来分离,分馏或测量可溶于水的分子(例如多糖和蛋白质)的分子量分布。

化学键合相色谱法

化学键合相色谱法是由液液分配色谱法逐渐发展而来的。虽然分配色谱法分离效果不错,但在分离过程,由于机械吸附在载体上的固定液可能会发生流失,流失的固定液会给基线带来大的噪声而降低检测器的灵敏度。因此,为了解决上述问题,研究人员利用不同的有机官能团通过共价键合的方式,将其键合到硅胶(载体)表面的游离羟基上,进而形成化学键合固定相,由此而逐渐发展成键合色谱法。

根据键合固定相与流动相相对极性的强弱,可将键合相色谱法分为反相键合色谱法和正相键合色谱法。反相键合色谱法使用共价键合在固定相颗粒上的烷基链形成疏水性固定相,该固定相对疏水性或极性较小的化合物具有更强的亲和力。而用极性(水性)溶剂作为流动相。因此,极性流动相中的疏水分子倾向于吸附在疏水固定相上,而流动相中的亲水分子则会通过色谱柱,先被洗脱。而疏水分子可以用有机溶剂(非极性)通过降低流动相的极性来洗脱,从而减少疏水相互作用。正向键合色谱法则与反向键合色谱法相反,其键合固定相的极性大于流动相的极性,更适用于分离油溶性或水溶性的极性和强极性化合物。

吸附色谱法

吸附色谱法基于化学物质在载体表面的吸附和解吸作用而保留化学物质。这种方法有时也称为液固色谱法。此方法的保留时间是基于分析物与流动相分子的竞争。化学品在吸附色谱中的保留程度取决于:(1)该化学品与载体的结合强度;(2)载体的表面积;(3)化学品从载体上转移出的流动相的量;(4)流动相与载体的结合强度。静电相互作用,氢键,偶极-偶极相互作用和分散相互作用(即范德华力)都可能影响此类色谱的保留。

 吸附色谱法原理图

图3 吸附色谱法原理图

参考文献:

Hermanson G T. Immobilization of ligands on chromatography supports[J]. Hermanson GT. Bioconjugate Techniques, 2013: 589-740.

Wolf, Marcell. Effective interactions in liquid-liquid phase separated protein solutions induced by multivalent ions. 2015. 10.15496/publikation-4822.

Kiselev A V, Yashin Y I. Gas-adsorption chromatography. Springer, 2013.

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