单细胞组学

单细胞分离,你需要了解的工具和技巧

你理想中的单细胞分离是快速而高效的,而现实中的过程也许是低效而漫长的。在此,我们将介绍一些单细胞分离的新技术,并分享一些操作时的小技巧。

如今,单细胞多组学分析正在如火如荼地开展,各大杂志上不断有重磅的新成果发表。也许您也跃跃欲试,不过在此之前,您需要分离出单细胞。您理想中的单细胞分离是快速而高效的,而现实中的过程也许是低效而漫长的。在此,我们将介绍一些单细胞分离的新技术,并分享一些操作时的小技巧。


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单细胞分离的挑战



准备分离单细胞的研究人员必须克服许多挑战。他们希望获得纯正的目标细胞群,且细胞的各种特征都保持不变。如何才算不错的分离方法?它应当保持细胞活力,提供足够数量的细胞,并且可根据未来的需求而扩展。它还能够防止细胞聚集,并且操作起来相对简单,费用也不太高。

日本应用科学家Elisa Lam博士认为,在选择合适的技术时还需要考虑通量(也就是一定时间内分离的细胞数)以及回收率(分离得到的目标细胞数与原始样品中的目标细胞数之比)。


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FACS的缺陷



由于速度和通量上的优势,荧光激活细胞分选(FACS)是常用的单细胞分离方法之一。不过,这些优点也被一些无法避免的缺点所抵消。Lam博士解释说:“在FACS分选过程中,高速碰撞发生时的高压、电荷和频率会导致一种应激现象,也就是分选仪器诱导的细胞应激(SICS)。这就限制了分选细胞在下游研究中的应用,对于那些研究敏感细胞(如球状体或神经元)的研究人员来说尤其是个问题。”

Namocell公司的应用科学家Rachel Agoglia认为,FACS的缺点是样本量大且操作复杂。“FACS通常至少需要100,000个细胞,因此不能分选数量稀少的样本,比如许多临床样本,”她谈道。“它也容易受到样本交叉污染和系统堵塞的影响。另外,FACS仪器占地面积大,并且需要培训过才能操作,因此不方便放在中心实验室。出于这些原因,许多研究人员正在寻找单细胞分离的替代方法。”


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新兴的微流体技术



与传统的FACS相比,新型微流体细胞分选仪具有不少优势。
它们使用较低的分选压力,降低了SICS的风险。
它们所需的样本量也较少,可将样本加入一次性的微流体芯片中进行分选。
Lam博士认为,基于微流体芯片的细胞分选仪的优势不仅在于处理微升级的样本。“这些系统还消除了样本交叉污染的风险,并且提高了分选细胞的质量。”

近年来,微流体技术已与其他学科整合在一起,进一步加强单细胞分离。Namocell的联合创始人Jessica Zhou解释说,将微流体技术与流式细胞仪和液体分配相结合,让研究人员能够直接分选细胞并分离到微孔板上,一步完成操作。“我们采用卡盒设计,每分钟能够处理数百万个细胞,从而快速分离出稀有细胞,或在抗体开发时挑出最佳克隆,这是FACS或传统分选仪无法做到的,”她说。

Jessica还补充了一些优点:“它跳过了传统分选仪的一些复杂操作,比如微球校准和液滴延迟校准。由于没有死体积,只需100个细胞即可实现单细胞分离,在处理珍贵的临床样本时,这也是一个重要的考虑因素。同时,低分选压力有助于克隆生长,也避免诱导应激基因。”

美国格拉斯通研究所干细胞核心实验室的主任Po-Lin So表示:“我们核心实验室正在寻找一些方法来加速人诱导多能干细胞(iPSC)的克隆,并在单细胞中分析基因编辑效率。”
在选择单细胞分离工具时,她有四条标准:
  • 无菌;

  • 温和;

  • 容易使用;

  • 价格合理。


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单细胞分离的小技巧



1、缩短制备单细胞悬液的时间,以保留细胞活力;
2、考虑使用细胞筛来过滤出细胞团块或双细胞;
3、注意缓冲液的选择,包括分选和收集溶液;
4、如果您打算在分选后培养细胞,请使用对数生长期的细胞,并确定最佳培养条件;
5、在分选转染后的细胞时,通常在转染后72小时进行,以提高细胞群的生存能力;
6、如果采用荧光抗体来分离稀有细胞,请在染色前离心抗体,以便去除任何可能被误认为是靶细胞的荧光颗粒;
7、对于单细胞基因组学应用,在分选后别忘了离心平板,以确保细胞在孔的底部;
8、选择一种可靠的分析技术来评估分选细胞的数量和质量。

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