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安诺Hi-C新突破,开启分析新篇章系列二

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目前Hi-C主要研究的生物学问题包括:个体发育过程中染色体构象的变化、DNA变异引起的表型变化、不同物种染色质构象特征研究。

目前Hi-C技术已经应用于遗传疾病-手指畸形 [1]、肿瘤发生发展[2]、X染色体失活[3]、细胞或组织衰老[4]、骨骼发育不全[5]等多种疾病及植物中染色体构象特征、发育过程的研究。

上期安诺Hi-C新突破,开启分析新篇章已为各位介绍了Hi-C技术结合RNA-seq、ChIP-seq等多组学技术共同解析差异构象是如何影响生物学问题发生和发展。但Hi-C研究生物学问题的基础在于找出样本间的三维构象差异。此次小编就具体来说一说样本间染色体三维构象差异是如何分析实现的。

 Hi-C数据长啥样?

Hi-C分析会对染色体以一定的窗口大小(如1M)进行划分,这个窗口大小叫做bin size,每一个窗口称作1个bin。通过把Hi-C得到的双端测序数据比对到各个窗口,我们就得到了各窗口的交互数值,以热图的形式展现染色体内所有bin之间的交互特点如下:

图1 染色体互作展示

 从哪些层级分析不同样品间的染色质构象差异?

目前研究的染色质构象特征一般分为下图所示的几个层级[6]:

图2 染色体不同层级构象

一般把数据做成不同bin size的矩阵来分析不同层级的染色质构象,不同层级的染色质构象对应用于分析的bin size大小如下图:

图3 不同层级的构象对应的分辨率大小

 具体每个层级是怎样进行差异分析的呢?

1、矩阵/热图的差减

每个样本都会有1个全基因组所有bin的交互矩阵,要比较两个样本染色质构象的差异,最简单的方法是对两个样本的交互矩阵进行差减,如下图:

图4 样本差减矩阵

注:MCF-10A是乳腺上皮细胞细胞系,MCF-7是乳腺癌细胞系,A、B图表示两个样本各自的全基因组交互热图,C图表示的是两个样本的差异,C图中偏红的表示在MCF-7中比MCF-10A交互强的位点,偏蓝的表示在MCF-7中比MCF-10A交互弱的位点。

2、样本间A/B compartments比较

在高等动物中基因组可以划分为两个compartments,称作A/B compartments,它们在基因组中一般呈间隔分布。研究发现A compartment通常与表达活跃的open chromatin相关,而B compartment与转录抑制的closed chromatin相关[7] 。A/B compartments在同一物种中有一定保守性,但一般具有组织特异性。通过对多样本A/B compartments 的分布进行对比,我们能把在A/B compartments构象上保守的基因组分析出来,同时也能分析易发生A/B compartments转换的区域,如下图:

图5 A/B compartments分析

然后对发生A/B compartments转换的区域涉及到的基因进行表达差异分布的统计,有助于解释样本特异性表达与染色质活性状态之间的关系。

3、样本间TAD边界变化的比较

在高等动物中,染色质的基本结构和功能单元是TAD[8]。TAD的边界通常具有绝缘子蛋白和黏连蛋白的富集,这些结构蛋白对于形成和维持TAD的稳定发挥了关键作用,TADs作为基础的调控单元来行使功能,TADs内有很多像enhancers和promoters之间的互作。TAD结构相对独立,其内部的互作远强于TAD之间的互作。

一般外界刺激(如:温度刺激或其他处理)、细胞分化过程、染色体结构变异会影响TAD边界的强弱(边界的清晰度)和TAD 内部的交互强度(TAD score),发生变化的TAD 所涉及到基因表达可能会发生变化,这个过程同时伴随着染色质结合蛋白结合情况的变化,也会对基因表达产生影响。

图6 TAD边界变化比较

样本间有意义互作的差异比较

利用Fit Hi-C软件分析得到全基因组范围内染色质的有意义互作,通过比较样本间染色质的有意义互作数据,结合染色体位置及其多组学数据,可识别是否存在样本特异的调控位点,从而阐明染色质互作差异与样本特异性表达间的关系。

图7 两样本有效互作比较

Hi-C技术是通过依托庞大的测序数据量来反应空间三维构象相互作用强度的,不同的层级水平(分辨率)需要不同数据量的支撑,以小鼠为例,100K分辨率PE150策略需要测120G数据,40K的分辨率需要250G数据,10K分辨率需要900G数据……如此大的数据量,您是不是有点小担忧呢?

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参考文献:

[1]Lupiáñez D G, Kraft K, Heinrich V, et al. Disruptions of topological chromatin domains cause pathogenic rewiring of gene-enhancer interactions[J].Cell, 2015, 161(5): 1012-1025.

[2]Barutcu A R, Lajoie B R, McCord R P, et al. Chromatin interaction analysis reveals changes in small chromosome and telomere clustering between epithelial and breast cancer cells[J]. Genome biology, 2015, 16(1): 214.

[3]Giorgetti L, Lajoie B R, Carter A C, et al. Structural organization of the inactive X chromosome in the mouse[J]. Nature, 2016.

[4]Chandra T, Ewels P A, Schoenfelder S, et al. Global reorganization of the nuclear landscape in senescent cells[J]. Cell reports, 2015, 10(4):471-483.

[5]Franke M, Ibrahim D M, Andrey G, et al. Formation of new chromatin domains determines pathogenicity of genomic duplications[J]. Nature, 2016,538(7624): 265-269. 

[6]Fraser J, Williamson I, Bickmore W A, et al. An overview of genome organization and how we got there: from FISH to Hi-C[J]. Microbiology and Molecular Biology Reviews, 2015, 79(3): 347-372.

[7]Lieberman-Aiden E, Van Berkum N L, Williams L, et al. Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome[J]. Science, 2009, 326(5950): 289-293.

[8]Dixon J R, Selvaraj S, Yue F, et al. Topological domains in mammalian genomes identified by analysis of chromatin interactions[J]. Nature, 2012,485(7398): 376-380.

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