科研动态

药物基因组学发展和应用【三】

药物基因组学为临床医生和临床药师提供了很大程度上改善几百万患者药物治疗效果的机会。但是,这个机会的利用却受到阻碍和挑战,并且新的知识还在不断的更新。

药物转运体的基因多态性

药物的生物利用度不仅取决于药物代谢酶的活性,在较大程度上也有赖于生物膜上转运体的活性。转运体分布在许多屏障组织如肠道、肝脏、血脑屏障、肾脏、胎盘、睾丸和淋巴细胞等的顶膜上,因此对血浆、组织液,甚至细胞内药物的分布都发挥着一定的作用。由于转运体的分布和功能表现出非常大的变异性,推测膜转运体基因的遗传变异可以解释一部分药物药代动力学和临床疗效上的个体差异。 根据不断增加的转运体成员,人类基因命名委员会对转运体作了标准化命名,分为两大类:ATP-结合盒转运体(ATP-binding cassette transporters,ABC转运体)和溶质载体(solute carrier,SLC)超家族。

一、ABC转运体

大部分外排性转运体属于ABC转运体超家族成员,可以影响多种细胞和组织内化合物的浓度。这些转运体在阻止外源性物质的侵入中发挥了主要的屏障作用。底物跨膜转运的能量来自ATP的水解和转运体中间物的磷酸化,使底物能够逆浓度梯度进行主动转运。人类ABC转运体共有49个成员,分为7个超家族(ABCA~ABCG)。ABC转运蛋白的核心结构通常由4个结构域组成,包括2个高度疏水的跨膜结构域(transmembrane domain,TMD)和2个核苷酸结合域(nucleotide-binding domain, NBD)。每一跨膜结构域一般由6个螺旋构成,也存在由10个、17个、19个螺旋组成的跨膜结构域。它们形成一个跨膜通道以实现底物分子的跨膜运输,同时还参与底物的识别过程。核苷酸结合域位于胞质,结合和水解ATP。

(一)ABCB1

编码ABCB1的基因位于染色体7q21.12,编码含有1280个氨基酸的多药耐药蛋白1(multidrug resistant 1,MDR1),在许多组织细胞中广泛表达。由于其结构中含有一个糖基,习惯上将其称为P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)。 P-gp是首个在人类组织中发现的ABC转运体,也是最为

重要的MDR介导因子。 P-gp除了在肿瘤细胞有分布外,在人体正常组织肝脏、肾脏、肠道、胎盘、血脑屏障、血睾屏障以及淋巴细胞系和心脏内小动脉、毛细血管等部位都有分布。P-gp主要位于这些细胞的绒毛面的一侧(顶侧),利用ATP水解释放的能量,将作用底物从细胞内转运至细胞外。这种对药物的逆向转运功能使得P-gp在药物的吸收、分布、代谢和清除方面具有重要意义。P-gp的作用底物范围非常广泛,主要转运疏水性的阳离子化合物。

ABCB1上目前为止发现的SNP有数百个,最早对SNPs进行的系统研究发现第26外显子上的沉 默突变3435C T与肠道P-gp的表达水平和地高辛的生物利用度的改变有相关性,3435TT突变纯合子携带者肠道P-gp的表达水平明显下降,地高辛血浆水平显著提高。随后的研究发现第21外显子2677G T/A的突变可以导致893位氨基酸的改变,并且2677G T/A 和 3435C T存在连锁不平衡关系。3435C T的发生频率存在显著的种族差异,3435T等位基因的发生频率在非裔黑种人中为17%-27%,亚洲人中为41%~47%,白种人中为52%~57%。ABCB1基因变异的功能意义目前还存在争议,许多研究发现3435T的变异会引起功能丧失,而另一些研究则不这样认为。3435C T是如何影响 P-gp表达的,目前机制还不是很清楚。

(二)ABCC2

ABCC2又名多药耐药相关蛋白2(multidrug resistance-associated protein 2,MRP2),或小管多种有机阴离子转运体(canalicular multispecific organic anion transporter,cMOAT),属于ABC转运体C亚家族中的一员。ABCC2主要分布于肝细胞的管腔(顶)膜和肾近端小管细胞的管腔膜侧,少部分位于肠道、胆囊上皮细胞、胚胎以及血脑屏障的内皮细胞等极性细胞的顶膜。 ABCC2基因位于10q24,共有32个外显子,其编码产生的蛋白由1545个氨基酸组成,含有17个跨膜螺旋结构,构成了3个跨膜结构域。ABCC2主动转运阴离子药物结合物,如葡糖醛酸盐类、硫酸盐类和谷胱甘肽结合物类,另外也可转运许多非结合类物质,被认为是解毒路径的重要一部分,见表5-3。此外,ABCC2也有助于抗癌药物如顺铂、长春碱、喜树碱衍生物等的转运。最近推测认为ABCC2可能参与了霉酚酸和环孢素之间的相互作用。 以前的研究发现常染色体隐性遗传疾病Dubin-Johnson 综合征(DJS)与肝脏内ABCC2的缺失有关,引起高胆红素血症。研究发现DJS患者ABCC2基因上核苷酸的置换可以影响MRP2的表达或功能。除了能引起DJS的一些突变外,最近ABCC2基因上发现了许多不引起DJS的SNPs,在不同种族的正常人群中发现了40多个SNP。考虑到MRP2在排泄过程中的重要性,推测认为这些多态性有可能引起转运和排泄活性的个体差异。 ABCC2最常见的基因多态性位点是5′端上游的−24C T,第10外显子的1249G A (V417I)和第28外显子的沉默突变3972C T。其它非同义突变2302C T (Ala768Trp)、 2366C T(Ser789Phe)、4348G A (Ala1450Thr)的发生频率比较低。其中2302C T在DJS患者中也有发现。由于突变位点2302C T、2366C T和 4348G A位于ATP结合位点附近,其潜在的功能影响还未被证实。

(三)ABCG2

ABCG2, 也就是所谓的BCRP(Breast cancer-related protein,乳腺癌相关蛋白)或米托蒽醌耐药蛋白,是ABC转运体中G亚家族的一个成员。ABCG2基因位于4q22,编码生成655个氨基酸的蛋白,分子量为72 kDa。ABCG2含有一个ATP结合域和一个跨膜区域,被称为半个转运体。在人体正常组织中,ABCG2主要表达于胎盘、结肠、小肠和肝脏。

ABCG2基因上报道的序列变异目前有80多个,对8个影响BCRP转运活性的非同义突变研究的比较多,其中5个是导致功能失活的:623T C(Phe208Ser)不在膜上,使BCRP表达降低;742T C (Ser248Pro)和1322G A (Set441Asn)位于蛋白的胞内域;376C T (Gln126X)和1000G T( Glu334X)导致编码提前终止,产生无活性的蛋白。另外两个突变位点34G A (Val12Met)和421C A (Gln141Lys)表现为蛋白功能的下降。34G A影响到BCRP蛋白在Lewis肺癌细胞血浆侧膜上的定位,而421C A与BCRP蛋白表达降低、ATP酶活性下降有关。421C A突变等位基因的发生频率存在种族差异,在亚洲人中的发生频率是35%,考虑到其突变的高发生率,以及BCRP的组织分布和亚细胞内定位,有助于一定程度上解释基因变异对于核苷衍生物分布的影响。最后,1291T C(Phe431Leu)变异对转运蛋白活性的影响表现为中等程度,其表现为不能转运抗癌药物甲氨蝶呤,但能够介导内源性底物血卟啉的泵出,由此也证明基因变异的影响也具有底物特异性和选择性。

二、SLC超家族

SLC超家族的大部分成员为摄取性转运体(uptake transporters),有助于化合物进入细胞内,尤其是营养物质和维生素;也有助于内源性物质如葡萄糖和其它小分子碳水化合物、氨基酸、短肽和核苷酸的摄取及胆汁酸的重吸收。SLC转运体本身不能水解ATP提供能量,其转运的驱动力来自原发性主动转运系统产生的电化学梯度,而进行继发性或三次主动转运;或在细胞膜内外的底物浓度差或电位差的驱动下,介导底物的易化扩散。

(一)有机阴离子转运肽

有机阴离子转运肽(organic anion-transporting polypeptides,OATPs)是SLC21的基因产物。OATP1A2是第一个被报道人类OATP家族成员,随后又发现了OATP1B1,现在人类OATP家族已经发现有11个成员,其中10个OATPs和一个前列腺素转运体OATP2A1(PGT)。这些OATPs广泛分布在与药物吸收和处置密切相关的器官组织,如肝脏、肾脏、小肠、脑和胎盘。由于广泛的组织分布及底物的选择性,可使多种药物吸收和处置的多个环节上发生相互作用。 OATPs可转运的底物种类非常广泛,OATP1A2可转运许多有机阴离子,包括胆盐、结合型和非结合型甾体激素、甲状腺激素,甚至一些小分子的阳离子如N –甲基-奎尼丁。另外许多药物,如非索非那定、δ啡肽II也被鉴定为OATP2的底物。OATP1B1在转运内源性胆盐、激素和胆红素上和OATP1A2有重叠,此外OATP1B1还能转运许多种类不同的药物,包括HMG-CoA还原酶抑制剂普伐他汀、匹伐他汀、罗苏伐他汀、阿托伐他汀,抗生素类利福平等。OATP1B3和OATP1B1的氨基酸序列有80%的同源性,底物范围也比较相似,此外,OATP1B3还可转运抗肿瘤药物甲氨蝶呤和紫杉醇。 OATP1B1是一个高度变异基因,其产物主要表达于肝细胞基底膜上。人群中已发现其44个突 变位点,其中17个为外显子非同义突变,4个为同义突变,20个位于内含子,其余3个位于基因启动子区。非同义突变中有7个为高频变异,在不同人群中它们的频率具有较大的差异。388A G(Asn130Asp)和521T C(Val174Ala)在非裔美国人中的频率分别为74%和1% ,亚洲人为63%和16% ,高加索人为40%和14% ;388A G和521T C分别被命名为OATP1B1*1b(388G/521T)和OATP1B1*5(388A/521C)突变,两种突变合称OATP1B1*15(388G/521C),野生型的则称 OATP1B1*1a(388A/521T)。452A G(Asn151Ser)仅在亚洲人中有发现,频率为3.8%; 463C A(Pro155Thr)和1929A C(Leu643Phe)则仅在高加索人中有报道,频率分别为8%和9% ;1463G C(Gly488Ala)和2000A G(Glu667Gly)则只在非裔美国人中有报道,频率分别为9%和34%。细胞水平和相关的临床研究显示,388A G,521T C,1463G C和2000A G等突变不同程度地降低了OATP1B1的转运活性。体内研究证实,OATP1B1的基因突变可影响多种药物的体内处置和排泄,普伐他汀非肾清除率在OATP1B1*5和*15突变个体中较OATP1B1*1a野生型纯合子个体明显下降,而*1b等位基因则可加快该药物的分布和代谢。除普法他汀外,这两个多态基因位点对罗苏伐他汀、匹伐他汀、辛伐他汀药动学也有类似的影响,而且相关研究提示,它们还可能是临床他汀类药物治疗中相关横纹肌溶解不良反应易感性的遗传因素。

在肝脏组织表达的OATPs中,除了OATP1B1外还有OATP2B1和OATP1B3。目前对后两者参与药物转运情况研究相对较少。已有报道表明OATP2B1外显子区具有高频多态变异1457C T(Phe486Ser)及1175C T(Thr392Ile)。1457C T在日本人中的发生频率是30.9%,与雌酮-3-硫酸盐转运Vmax的降低有相关性。在高加索人群中发现了OATP1B3的3个非同义突变:334T G(Ser112Ala),699G A(Met233Ile)、1564G T(Gly522Cys),频率分别为78%、71%和2% 。比较它们的功能时发现,携带334G和699A等位基因的OATP2B1具有相同的磺溴酞钠与胆汁酸的转运能力,而1564T突变则使之完全丧失磺溴酞钠的转运活性。值得关注的是,OATP1B3是唯一转运强心苷类地高辛和胆囊收缩素到肝细胞内的OATP转运体,因此基因变异对于OATP1B3特异性底物体内转运的影响值得进一步的研究。SLCO1B3基因的转录调控因子法尼醇X受体(farnesoid X receptor,FXR)可以改变OATP1B3的表达水平,体外研究发现与肝脏内野生型纯合子FXR*1A 相比,FXR*1B(SNP -1G T)杂合子个体可降低OATP1B3的mRNA表达水平。 OATP1A2是OATP超家族中另一个受到关注的药物转运体。由于该转运体主要分布于大脑毛细血管内皮细胞,成为一些物质进入中枢神经组织的通道,对中枢组织药物浓度大小及效应具有重要影响。在一些人群的基因序列对比研究结果表明,OATP1A2相对变异程度小,但仍然存在一些多态变异位点。在非裔美国人中,先后发现404A T(Asn135lle)、516A C(Glu172Asp)以及2003C G(Thr668Ser),其频率分别为11%,5%和4%。体外研究提示516C、404T和2003G为活性低下的OATP1A2等位基因,它们可能是一些中枢作用的药物效应或不良反应个体差异的重要原因。

(二)有机阴离子转运体

有机阴离子转运体(organic anion transporter,OAT)是SLC22基因家族产物,能够转运具有各种不同化学结构的有机阴离子,包括多种内源性物质如马尿酸盐、尿酸、环核苷酸和前列腺素等及一系列外源性化学物。目前,OAT主要成员如OAT1,OAT2,OAT3,OAT4,OAT5,OAT6,尿酸转运蛋白1(urate transporter1,URAT1)等的基因,均已从不同的种属中克隆得到 。其中,OAT1和OAT3是主要分布在肾脏和脑;OAT2主要分布在肝脏;OAT4主要分布在胎盘和肾脏。 研究发现,OAT抑制剂如丙磺舒和西司他丁等,与β-内酰胺类抗生素合用时,可延长这些抗生素在血液中清除的半衰期并减少肾毒性的发生 。这一现象表明,一种或多种OAT可能介导了β-内酰胺类抗生素在肾小管上皮细胞中的蓄积。后来有研究表明,3种主要的β-内酰胺类抗生素青霉素G、头孢噻啶和亚胺培南等均可由人OAT1,OAT2,OAT3以及OAT4所特异性转运,而且这种转运可被OAT抑制剂所抑制。有研究表明,OAT在其他一些具有肾毒性的药物或环境毒物如甲氨蝶呤、非甾体类抗炎药和赭曲霉素A等所引起的毒性反应中也起着重要作用。

OAT1的编码基因为SLC22A6,几个重要的SNPs呈现种族差异性。非同义突变20T C(Leu7Pro)、311C T(Pro104Leu)、767C T(Ala256Val)、877C T(Arg293Trp)、1316G A(Arg454Gln)和1575A T(Lys525Ile)只在非裔人群中有发现。编码生成OAT3的基因SLC22A8编码区至少发现有12个非同义SNPs,在日本人的研究中发现,与野生型蛋白比较,1166C T(A389V)变异等位基因携带者普伐他汀的清除率有些微的差异。在亚裔中Ile305Phe位点的突变率 3.5% ,这种突变降低了OAT3对底物的转运,并在一定程度上改变了0AT3底物的特异性,多种药物如西米替丁的代谢排泄也随之发生改变。其它发现能够改变雌酮-3-硫酸盐和西米替丁转运的SNPs还有445C A(Arg149Ser)、779T G(Ile260Arg)和715C T(Gln239STOP)。

(三)有机阳离子转运体

有机阳离子转运体(organic cation transporter,OCT)属于SLC超家族的重要一员,主要分为3个亚类,为OCT1、OCT2 和OCT3。 OCT1主要分布于肝细胞基底膜上, OCT2 主要分布于肾小管上皮细胞的外侧基底膜上, OCT3 的组织分布较为广泛,包括脑、心脏、骨骼肌、血管、肝脏和胎盘等组织。 OCTs在人体内主要负责转运一些在生理pH环境中呈现阳离子状态、且相对分子量不大的内外源性物质。OCT1在将药物等内、外源性物质由肝血窦转运进入肝细胞内的这一过程中起到关键作用。经由OCT1转运的内、外源性物质有很多,常见的内源性物质包括皮质酮、雌二醇、前列腺素E2等;经其转运的常见药物包括组胺受体拮抗剂西米替丁、雷尼替丁和法莫替丁,双胍类降糖药二甲双胍和苯乙双胍,抗病毒药物阿昔洛韦和更昔洛韦,帕金森治疗药物美金刚等。此外,还有一部分药物不经OCT1 转运,但对其有抑制效应,最具代表性的是非甾体类抗炎药吲哚美辛、双氯酚酸和匹罗希康。 

OCT1的编码基因为SLC22A1, 位于染色体6q26。OCT1的多个SNPs的等位基因频率存在种族差异,181C T(Arg61Cys)、262T C(Cys88Arg)和17857G A(Gly401Ser)3种SNPs仅在白种人中发现,频率分别为9.10%,0.60% 及3.20%,而848C T(Pro283Leu)和964C G(Arg287Gly)尚未在白种人中发现,848C T(Pro283Leu) 在韩国人和中国人中的突变发生频率分别为1.3%和0.5% 。以1-甲基-4-苯基吡啶(MPP+)和四乙胺(TEA)为底物来检测OCT1 SNPs对其转运活性的影响,发现携带有848C T(Pro283Leu)和859C G(R287G)的个体对MPP和TEA的转运能力下降。 OCT2 参与了包括药物在内的一系列内外源性物质由血液经主动分泌进入肾小管腔并进一步被排泄这一生理过程。在这一过程中,位于近曲小管细胞基底外侧膜上的OCT2 以异化扩散的方式将呈阳离子状态的内、外源性物质转运进入小管细胞。可以被OCT2 转运的内源性物质包括去甲肾上腺素、52羟色胺、组胺、多巴胺和肌苷等。经由OCT2 转运的药物与OCT1 存在着很大的交叉性, 如经由OCT1 转运的二甲双胍、苯乙双胍、美金刚、西咪替丁、雷尼替丁、法莫替丁等同时也是OCT2 的底物,另外OCT2 还转运奎宁等其他药物。OCT2 的抑制剂包括可卡因、地昔帕明、丙米嗪、格帕沙星、普鲁卡因酰胺、奎尼丁、甲氧苄氨嘧啶、维拉帕米等。 在美洲黑人中发现495G A(Met165Ile)、1198C T(Arg400Cys)和1294A C(Lys432Gln) 突变均可以导致OCT2 的转运功能下降。在日本和韩国人中发现的2个突变596C T( Thr199Ile)及602C T(Thr201Met),均导致OCT2对于MPP+ 和二甲双胍的吸收功能明显减低。

808G T(Ala270Ser) 突变能够使MPP+ 的Km 值和TEA 对于MPP+ 抑制作用的Ki 值下降大约两倍,而此突变是OCT2 所有基因突变中频率最高的,在所有种族中均有发现。在808G T过表达的细胞中,MPP+ 的内在清除率下降了大约20 倍,提示OCT2的突变主要对转运蛋白的Vmax 产生影响,而非结合的亲和力。 口服二甲双胍因为不被代谢而经由肾脏清除,而OCT2 主要分布在肾脏,所以OCT2 在二甲双胍的分布上起重要作用。研究发现SLC22A2 三个SNPs , 596C T、 602C T以及808G T突变可以导致OCT2对于二甲双胍的摄取降低,二甲双胍血药浓度增高, 肾清除率降低。因为二甲双胍主要通过OCT2的主动分泌而清除, 在全部清除率中占80 %以上, 所以OCT2 转运功能受影响必定导致二甲双胍肾脏清除率受影响。

(0)

热评文章

发表评论