基因组学

DNA甲基化检测技术应用与技术比较

DNA甲基化作为表观遗传学研究的重要范畴,已经越来越受到研究者的关注。近些年来,随着DNA甲基化与组蛋白甲基化的联合作用机制、RNA干扰机制及去
甲基化机制的发现,使得DNA甲基化研究受到广泛关注,从医学领域扩展到动植物研究当中,同时在研究方法上也取得了很大的突破。现在用于DNA甲基化检测
的方法大概有十多种,从应用上来分,大致可以分成两类:全基因组甲基化分析及特异位点甲基化检测。下面,我们就这两大类检测技术进行分析比较,以便于在实际的科研工作中进行选择。

一、全基因组甲基化检测技术

1. 基于芯片平台的全基因组甲基化筛选

芯片平台作为目前比较成熟的筛选工具,已经在很多领域有了相应的应用。多家芯片公司在DNA甲基化这块儿有了相应的产品提供,其中应用最为广泛的就
Agilent平台和Illumina平台,相应的产品包括Agilent Human CpG Island Microarray
Kit,Infinium HumanMethylation27 BeadChip和Infinium HumanMethylation450K
BeadChip。另外Roche NimbleGen和Affymetrix也有相应的芯片推出,但是NimbleGen的芯片今年下半年已经停产。

不同的芯片平台,各自的实验过程也是不一样的。安捷伦前期采用的甲基化DNA免疫共沉淀(MeDIP)技术。将基因组DNA分成两份,一份用来做
MeDIP,另一份作为对照。两个样品都标记荧光(富集的样品用Cy5标记,对照用Cy3标记),然后与芯片杂交。芯片上每个探针的Cy5/Cy3强度比
例显示出该区域的甲基化程度。

安捷伦公司芯片平台因其强大的eArray探针设计平台,可以进行芯片的定制。在甲基化领域同样适用。

Agilent平台因为MeDIP技术本身的特点,都不能到达单碱基的分辨率,而Illumina的Infinium和GoldenGate检测技术却做
得到。Illumina的Infinium甲基化检测技术来源与前期的SNP检测,采用的是单碱基延伸的原理。分析利用两个位点特异的探针检测这些序列差
异的位点,一个探针是为甲基化位点(M磁珠类型)设计的,而另一个是为未甲基化位点(U磁珠类型)设计的。探针的单碱基延伸掺入了一个标记的ddNTP,
它随后被荧光试剂染色。通过计算甲基化与未甲基化位点的荧光信号比例,可确定检测位点的甲基化水平。Illumina公司早期推出的Infinium
HumanMethylation27
BeadChip芯片覆盖27,578个CpG位点。这款芯片在医学领域有广泛的应用,除了和肿瘤相关的甲基化筛选之外,也能用于其他疾病相关甲基化检
测。因此对这款产品,研究者给予了很高的评价,目前此产品已停产,取而代之的是Infinium HumanMethylation450
BeadChip芯片。它以单碱基分辨率覆盖了基因组中超过45万个甲基化位点,实现了基因区域和CpG岛的全面覆盖。此外,还包括CpG岛之外的CpG
位点,在人类干细胞中鉴定出的非CpG甲基化位点,以及肿瘤和正常组织中差异表达的甲基化位点等等。它的高覆盖度、高通量以及低价格,让它成为进行全基因
甲基化筛选的有力武器。

相比之下,VeraCode
GoldenGate甲基化分析技术更适合中通量的筛选及验证研究,它以以矩阵微珠芯片(Sentrix Array
Matrix(SAM))形式分析48至384个用户指定的CpG位点。首先,将亚硫酸氢盐处理的基因组DNA
与分析oligo混合,oligo与未甲基化位点的U互补,或者与甲基化位点的C互补。杂交之后,引物延伸,并连接上位点特异的oligo来产生通用
PCR的模板。最后,用标记的PCR引物生成可检测的产物。据Illumina的产品专家介绍,其产品的最大优势在于单个CpG位点的分辨率。其它分析将
甲基化定位在一段区域,而通过Illumina分析,你能精确测定某个CpG位点的甲基化水平。

2. 基于高通量测序平台的甲基化图谱分析

随着二代测序技术的告诉发展,测序成本大幅度下降,使得真正实现全基因组甲基化分析的研究成为可能。随着人类甲基化图谱绘制成功,已经陆续有多个物种的甲
基化图谱构建完成。研究者将传统的DNA甲基化检测方法,如亚硫酸氢盐转化与高通量测序相结合,可以实现单碱基精度的甲基化图谱的构建。此外将成熟的
MeDIP技术与二代测序相结合,可以快速有效地寻找基因组上的甲基化区域,从而比较不同细胞、组织、甚至疾病样本间的DNA甲基化修饰模式的差异。因此
该技术也特别适用于大样本量的疾病表观研究。

第三代测序技术的出现,更是让甲基化的直接测定成为可能。一年前,美国Pacific Biosciences公司利用独有的单分子实时(SMRT)测序技术,直接测定了DNA的甲基化。这项成果发表在《Nature Methods》杂志上。

二、特异位点甲基化检测技术应用比较

1.甲基化特异性PCR(MS-PCR)

DNA在亚硫酸氢盐作用后,DNA
CpG若无甲基化,则序列中的C改变为U,若有甲基化则保持不变,因此从理论上讲,用不同的引物做PCR,即可检测出这种差异,从而确定基因有无CpG岛
甲基化。因此根据目的基因修饰前后的改变,就可以相应设计M和U引物,有时我们需要设计两轮引物。

这种方法灵敏度高,无需特殊仪器,因此经济实用,是目前应用最为广泛的检测方法。不过也存在一定的局限性,预先需要知道待测片段的DNA序列,引物的设计非常重要。另外,亚硫酸氢盐处理也十分关键,若处理不完全则可能导致假阳性的出现。

2. 亚硫酸氢盐测序PCR(BSP)

这种方法一度被认为是DNA甲基化分析的金标准。它的过程如下:经过亚硫酸氢盐处理后,设计引物进行PCR扩增目的片段,并对PCR产物进行克隆测序,将
序列与未经处理的序列进行比较,判断CpG位点是否发生甲基化。这种方法可靠,且精确度高,能明确目的片段中每一个CpG位点的甲基化状态,但因为涉及到
测序,其结果准确但要求克隆时所挑克隆较多,操作繁琐,不易大批量操作。另外,甲基化程度的定量依赖于挑选克隆的数目,因此这种方法只能算得上是一种半定
量的技术方法。

目前一般会先用BSP找到甲基化位点,然后根据甲基化位点设计MSP引物,进行相应PCR条件摸索,以用于大量样本的筛选。

3.甲基化敏感性高分辨率熔解曲线分析(MS-HRM)

通过熔解曲线分析可以将单碱基序列的差异转变成熔解曲线的差异,因此DNA样本经过亚硫酸氢盐处理后,甲基化与未甲基化DNA会存在序列差异,这种差异可
通过熔解曲线分析来发现。使用该方法进行甲基化分析仅需一对引物,相对简单,不过这种方法对仪器的要求颇高,需要带HRM模块的荧光定量PCR仪,并且在
进行实时定量PCR过程中,需要使用饱和的荧光染料。利用MS-HRM技术进行甲基化检测只能对检测片段整体甲基化情况进行分析,并不能明确每个CpG位
点的甲基化状态。因此这种技术适用于大量样本的检测,筛选出感兴趣的CPG位点,然后利用其他方法进行单个位点的精确检测及甲基化程度的精确定量。

4. 联合亚硫酸氢钠的限制性内切酶分析法(COBRA)

这种方法是将亚硫酸氢盐处理与酶切相结合来进行甲基化检测。DNA样本经亚硫酸氢盐处理后,利用PCR扩增。扩增产物纯化后用限制性内切酶(BstUI)
消化。若其识别序列中的C发生完全甲基化(5mCG5mCG),则 PCR扩增后保留为CGCG,BstU
I能够识别并进行切割;若待测序列中,C未发生甲基化,则PCR后转变为TGTG,BstUI识别位点丢失,不能进行切割。这样酶切产物再经电泳分离、探
针杂交、扫描定量后即可计算出原样本中甲基化的比例。

这种方法最大的优点就是相对简单,可进行快速定量,且需要的样本量少。然而,它的局限性也十分明显,只能获得特殊酶切位点的甲基化情况,且阴性结果并不能排除样品DNA中存在甲基化的可能。

5. 荧光定量法(Methylight)

这种技术是在MSP技术上发展起来的,在MSP扩增过程中利用荧光染料进行定量。TaqMan?
探针法的应用使得该技术具有更高的精确性。其原理与SNP检测类似,针对亚硫酸氢盐处理之后的DNA片段,在甲基化位点上会存在单碱基的差异,根据这种差
异进行探针设计,随后进行实时定量PCR,就能够检测甲基化的差异。这种方法最大的优势在于其高敏感性和较高通量,且无需在PCR后电泳、杂交等操作,减
少了污染和操作误差。但是TaqMan? 探针订购费用较高,适用于少数位点大量样本筛选。

6. 焦磷酸测序(Pyrosequencing)

随着技术的不断改进,现在认为焦磷酸测序技术(Pyrosequencing)是甲基化检测新的金标准。焦磷酸测序作为一种新的序列分析技术,能够快速地
检测甲基化的频率,对样品中的甲基化位点进行定性及定量检测,为甲基化研究提供了新的途径。在序列延伸过程中,根据C和T的掺入量来定量确定单个位点的
C-T 比例。因此,不同位点的甲基化变异就能被准确检测,并给出精确的甲基化程度的数据。

QIAGEN公司在焦磷酸测序的应用上具有明显的优势,目前提供三种焦磷酸测序仪器,通量由低到高,适合不同的应用。PyroMark Q24
的强项在于可对多达24个样品进行焦磷酸测序。需要大样品量的应用更适合在PyroMark Q96 ID
上进行。在考虑到处理成百上千个样品所需的大量试剂时,运行通量最大化可能会使实验成本变得很高。而PyroMark Q96
MD装有一台高度灵敏的光检测摄像头,可以在减少试剂量的情况下对少量的DNA模板进行准确测序。这些不同平台的推出,对于我们实际研究提供了更有效的检测手段。

虽然焦磷酸测序可以进行单个位点甲基化程度的精确定量,但是目前来看,测序的片段长度还比较短,只有一百多bp,其中有效长度约为60bp。

以上是对几种常用的特异位点甲基化检测方法进行了介绍及比较,还有一些检测技术是在常用的检测手段上进行优化或者将不同的方法进行结合应用,比如以MSP
方法为基础,发展了SMART-MSP技术,该技术利用定量技术对MSP扩增过程进行检测,同时后续结合HRM技术来分析甲基化差异。此外,利用质谱平台
进行甲基化检测的有MALDI-TOF技术,可以对甲基化进行精确检测并能进行高通量筛选。从对这些技术的比较分析来看,没中检测技术都有各自的优点,并也存在一定的局限性,研究者可以根据自己的实际研究情况进行选择。






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