基因组学

定量PCR的那些事

  定量PCR又被称Real-time PCR或是Quantitative Real-time PCR(以下简称Q-PCR)。现在很多实验室都有涉及到这一实验技术,这篇文件将讲述Q-PCR的原理,实验过程以及一些问题分析。
Q-PCR是利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化,通过Ct值和标准曲线的关系对起始模板进行定量分析。

荧光阈值:前15个循环信号作为荧光本底信号(baseline),荧光阈值的默认设置是3~15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍,如果手动设置则设置大于荧光背景值和阴性对照的荧光最高值,进入指数期的最初阶段。如图1


Ct值定量的数学原理
1. 理想的PCR反应:
Xn=X0*2n
n:扩增循环数;X0起始模板数量;Xn:第n次循环后扩增产物数量
2. 非理想的PCR反应:
Xn=X0*(1+En)n
n:扩增循环数;X0起始模板数量;Xn:第n次循环后扩增产物数量;En:扩增效率
在扩增产物达到荧光阈值时
(1)XCt=X0*(1+En)Ct=M
XCt::荧光扩增信号达到阈值时扩增产物的量,在阈值设定以后,它是一个常数,定为M
(1)两边同取对数得
(2)Log2M=Log2X0 *(1+En)Ct
整理方程式(2):
Log2X0= Log2M - Ct Log2(1+En)
因此起始模板量的log值与CT值成线性关系,模板DNA量越多,荧光达到阈值的循环数越少,即Ct值越小。
常用荧光定量标记方法
1. 非特异性荧光标记:SYBR Green I
这是一种最为常用的荧光标记。它是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料。在游离状态下,SYBR Green I发出微弱的荧光,但一旦与双链DNA结合后,荧光大大增强。因此,SYBR Green I的荧光信号强度与双链DNA的数量相关,可以根据荧光信号检测出PCR体系存在的双链DNA数量。如图2

SYBR Green I 染料法——优缺点
优点:使用方便,不必设计复杂探针;具有价格优势
缺点:无模板特异性;对引物特异性要求较高;不能进行多重定量;灵敏度相对较低
2. Taqman 探针法

探针完整,R发射的荧光能量被Q基团吸收,无荧光,但是Taq酶有5’→3’ 外切核酸酶活性,在PCR进行时,可水解探针将R与Q分开,R就能发荧光。如图3


Taqman 探针法——优缺点
优点:高度特异性;重复性好;灵敏度高;可进行多重定量
缺点:只适合一个特定的目标;委托公司标记,价格较高;不易找到本底低的探针
Q-PCR引物设计原则(主要是SYBRGreen I 染料法,★数量代表了优先程度)

Q-PCR的流程(主要是SYBR Green I 染料法)
1. RNA抽提:利用试剂盒或是传统的Trizol抽提样本总RNA。之后利用NanoDrop或是Qubit对抽提的RNA进行浓度测定,并进行电泳检测,确定RNA的完整性。
2. 反转录:每个样本根据浓度选取相同的量进行反转录,反转录产物稀释10倍混匀后-20℃保存备用。
3. Q-PCR:更具不同试剂盒所提供的反应体系配置。因为SYBR Green染料在强光的照射下会对染料造成影响。但是其实也不用过分的小心。一般来说Q-PCR的操作环境要求在没有DNA和RNA污染的环境且没有DNA酶。因此需要实验室有一个专门的定量房间,如果实验室条件不允许也可以在超净台中进行操作,并佩戴无菌乳胶手套。由于染料对光线敏感,操作时应避免强光的照射,如果操作允许,可以适当降低环境灯光亮度,但不必过分担心,主要还是操作过程要快。加完样品后上机PCR。
4. 数据分析:主要是看扩增曲线,CT值,以及溶解曲线。
以上就是Q-PCR的一个大致流程,所有实验中遇到的试剂或是耗材都要求无菌无RNase以及DNase。
实验中可能会遇到的问题:

答:一般来说CT值在30以下都可以认为实验结果是可靠的,如果CT值大于30那么基本上可以说明该基因没有扩增。但这也不是绝对的,还可以通过分析产物电泳结果,也可以分析溶解曲线。

答:一般正常的溶解曲线的峰应该出现在80℃以上且有且只有一个单一的峰,这样的实验结果是可靠的。如下图。

如果出现双峰,则说明有非特异扩增或是有引物二聚体(如下图),这样就需要电泳检测是引物二聚体还是非特异扩增。如果是引物二聚体那么可以适当降低引物浓度或是提高退火温度。如果是非特异扩增则除了提高退火温度外还可以重新设计新的引物。

答:这可能是因为配置混样后没有充分混匀,导致三个复孔间会出现差异。还有一种可能就是引物设计缺乏特异性或是引物与模板不匹配,这样也会导致复孔的结果出现差异,建议充分混匀反应mix,还是不行则考虑重设引物。

答:先确定你的引物是否来源于成熟的文献,也就是排除引物的问题。如果确定引物无为题,那就有可能是RNA的抽提时出现了降解导致了RNA片段的不完整,这样就需要重新抽提RNA并反转。如果内参基因是自己设计的,那就需要重新验证该基因的可行性,尽量选择成熟有过验证的内参基因。

答:这种情况就说明有基因组DNA的污染。在反转录结束后,cDNA需要进行简单的基因组排除验证,利用有跨越内含子的引物做PCR。模板利用cDNA以及基因组DNA,看条带大小。一般来说以cDNA为模版的产物小于基因组的产物。条件允许的可以选择带有去基因组酶的反转录试剂盒。

答:这是由于模板的起始浓度过高,可以尝试稀释模板,因为模板浓度过高不利于Q-PCR。   







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