基因组学

SNP/CNV/AFLP基因分型实验技术服务

因分型 (Genotyping) 是利用生物学检测方法测定个体基因型 (Genotype) 的技术。又称为基因型分析 (Genotypic assay)。

SNP

SNP全称Single Nucleotide Polymorphism,即单核苷酸多态性,是指在基因组上单个核苷酸的变异,包括转换,颠换,插入和缺失,形成的遗传标记,其数量很多,多态性丰富,有些SNP位点直接影响基因功能,从而导致生物性状改变。

SNP是研究人类家族和动植物品系遗传变异的重要依据,因此被广泛用于群体遗传学研究和疾病相关基因的研究。首先通过PCR扩增含有SNP的基因组片段,然后通过序列特异性引物实现单碱基延伸,随后样品分析物与芯片基质共结晶后在真空管中受瞬时纳秒 (10-9s) 强激光激发。核酸分子因此解吸附成为单电荷离子,由于电场中离子飞行时间与离子质量成反比,通过检测核酸分子在真空管中的飞行时间而获得样品分析物的精确分子量,从而检测出SNP位点信息。

技术流程如下图:

基因分型

PCR-LDR技术是PCR技术和LDR(Ligase Detection Reaction,连接酶检测反应)相结合的检测技术。

LDR是利用高温连接酶实现对基因多态性位点的识别。高温连接酶一旦检测到DNA与互补的两条寡聚核苷酸接头对应处存在着基因点突变类型的碱基错配,则连接反应就不能进行,反之则可以进行连接反应。

基因拷贝数变异(copy number variations, CNVs)

是指DNA片段大小范围从kb到Mb的亚微观突变,是最新一代的遗传标记物。通过实时监测PCR过程达到精确定量起始模板拷贝数的技术。它的基本原理是分别针对待检测基因上的序列和对照基因序列设计两对引物和标记不同荧光基团的检测探针。通过对扩增后两个探针信号指示的Ct值进行比较从而判断目标基因拷贝数。针对目标基因的序列设计相应的寡核苷酸杂交探针对,分别杂交于DNA上相邻的部位。当杂交探针与基因组DNA充分杂交后在连接酶作用下连接形成一条可供扩增的完整的杂交探针。这样就将目标基因的拷贝数等比例转化为可供扩增的杂交探针的数目。通用引物扩增后长度各异的PCR产物经过毛细管电泳分析,在图谱上通过不同产物峰的相对面积比即可判断目标基因拷贝数。

 AFLP技术

扩增片段长度多态性(amplified fragment length polymorphism, AFLP)是一项DNA指纹技术。基本原理是:通过对基因组DNA酶切片段的选择性扩增来检测DNA酶切片段长度的多态性。由于不同物种的基因组DNA大小不同,基因组DNA经限制性内切酶酶切后,产生分子量大小不同的限制性片段。使用特定的双链接头与酶切DNA片段连接作为扩增反应的模板,用含有选择性碱基的引物对模板DNA进行扩增,选择性碱基的种类、数目和顺序决定了扩增片段的特殊性,只有那些限制性位点侧翼的核苷酸与引物的选择性碱基相匹配的限制性片段才可被扩增。扩增产物经放射性同位素标记、聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,然后根据凝胶上DNA指纹的有无来检验多态性。

反应流程主要包括模板DNA制备、酶切片段扩增、凝胶电泳分析三个基本步骤:

1.制备高分子量DNA,选择6个碱基识别位点的限制性内切酶

2.酶切后的限制性片段在T4 DNA连接酶的作用下与特定的接头相连接,形成带有接头的特异性片段。

3.DNA片段的预扩增。

4.在Taq DNA聚合酶的作用下,完成AFLP的选择性扩增。

5.PCR产物变性后在含尿素的聚丙烯酰胺变性胶上电泳

6.多态性比较分析,特定片段回收克隆分析。





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