基因组学

CRISPR-Cas9基因敲除技术原理

这是一篇针对实验室萌新写的关于CRISPR-Cas9技术的详细介绍,对于实验室老手也建议收藏转发给师弟师妹,这样省心省力,又能节省大量讲解时间,这不香么?

原核生物的“免疫系统”

人体有着一套复杂且高效的免疫系统,时刻保护着我们免受病毒和细菌的攻击。但是,对于弱小又无助的原核细胞而言,它们也是急切需要被保护的。为此,经过几亿年的进化,细菌和大部分古细菌衍生出了CRISPR-Cas系统,用于保护它们免受外源DNA和噬菌体的侵染。到目前为止,科学家们发现50%的细菌和超过90%的古细菌均携带有CRISPR-Cas系统。CRISPR是一段高度重复的DNA序列,两端重复序列之间存在着各不相同的spacer序列,表达Cas蛋白家族的基因簇位于CRISPR位点的上游,其表达翻译的几种类型的Cas蛋白作为原核生物免疫应答的效应器发挥着重要作用。

当细菌受到噬菌体的侵染时,被释放到细菌细胞质中的噬菌体基因组的某段DNA序列被识别并整合到CRISPR的spacer区域,随后转录出相应的crRNA前体(pre-crRNA)。crRNA前体经过修饰和加工,生成向导RNA(guide-RNA)。由于gRNA中存在一段来源于噬菌体基因组的序列,因此gRNA可以通过碱基的互补配对原则识别噬菌体的基因组。同时存在于细胞质中的gRNA和Cas蛋白特异性结合,并靶向到噬菌体基因组参与DNA的切割与降解。

CRISPR-Cas9技术

简单来讲,CRISPR-Cas9是一种分子生物学技术,通过这种技术科研人员可以对细胞和生物体内的基因进行编辑。所谓的基因编辑就是通过某种生物手段和技术,对生物体内的遗传物质进行修改。

基于原核生物的获得性免疫系统研发出的CRISPR-Cas9技术只包含两种重要的成分,一种是行使DNA双链切割功能的Cas9蛋白,而另一种则是具有导向功能的sgRNA(single guide RNA)。当细胞内同时表达sgRNA和Cas9蛋白时,Cas9蛋白通过与sgRNA结合,靶向到目的DNA序列上发挥DNA双链切割的功能。DNA序列被切割产生断裂后,引发细胞内部的DNA修复机制(DNA repair)。真核细胞同时存在着同源重组修复和非同源重组修复。在同源重组修复下,断裂的染色体以另一条完整的姐妹染色单体为模板进行DNA修复,而在非同源重组修复下,断裂出的DNA随机修复,引入新的碱基,使基因产生移码突变。

基于CRISPR-Cas9的基因敲除

CRISPR-Cas9其中一种最为重要且广泛的应用便是基因敲除。

那么,基因敲除又是什么呢?

从很久以前,生物学家们就热衷于一种研究策略,那就是功能缺失策略(loss of function)。常规的理解是这样的,当我们想要去研究某个基因在整个基因组中的作用时,只需要通过某种方法将这个基因从基因组中剔除,然后观察去除这个基因之后,这个细胞或生物体会发生怎样的变化,然后根据这些变化去推断这个基因的功能。基因敲除就是用来描述将某个或某些基因从基因组中剔除这件事,而基因敲除技术则是用于完成这件事的方法或技术。

那又该如何实现基因敲除呢?

在实际实验过程中,我们只需要将Cas9蛋白和设计好的gRNA同时“运送”进细胞中即可,接下来的就交给细胞自己去操作了。

那么,对于转导gRNA和Cas蛋白的常见方法主要有四种:

1)RNP法。直接将大量的gRNA和Cas9蛋白,通过电转的方式转染目的细胞

2)病毒法。构建慢病毒(LV)敲除质粒,经病毒包装和纯化后转染细胞,将sgRNA和Cas9蛋白元件整合到细胞基因组中,从而使细胞源源不断地生产sgRNA和Cas9蛋白。

3)常规质粒法。构建常规敲除质粒,通过电转将其导入细胞,短时间内表达gRNA和Cas9蛋白。

4)转座子法(PiggyBac)。将携带有PB转座子和piggyBac转座酶(PBase)的质粒共转染细胞,转座酶促进转座,将高拷贝的Cas9蛋白和gRNA表达元件随机整合到基因组,实现gRNA和Cas9蛋白的持续表达。

这四种方法各有优劣,我们在选择时可根据所研究的靶基因及靶细胞的特性,选取适合自己研究要求的方法。这期的分享就到此为止,相信看到这大家对CRISPR-Cas9技术已经有了不错的理解。





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