蛋白质组学

Anal. Chem. TMT标记实现HNE修饰蛋白的大规模鉴定和定量:从外源到内源

       大家好!推荐一篇Anal. Chem.的文章,Selective Identification and Site-specific Quantification of 4-Hydroxy-2-Nonenal Modified Proteins。通讯作者是复旦大学的陆豪杰教授,其课题组以分析化学的方法学为基础,发展了一系列蛋白质分析的新方法,如利用小分子化学衍生或新型复合纳米材料等提高蛋白质组中目的蛋白的质谱分析灵敏度。

       HNE是氧化压力诱导产生的一种脂质过氧化物,目前研究已知其对蛋白的修饰会干扰大量重要的信号通路,如NF-κB, AKT, Nrf2,和 mTOR,HNE修饰的蛋白与许多疾病密切相关。因此,鉴定和定量HNE修饰的蛋白十分重要,有利于其相关分子机制的研究。本文即利用six-plex isobaric labeling affinity purification (SiLAP)的策略对复杂蛋白质组中HNE修饰的位点进行了鉴定和定量。

      蛋白上的HNE修饰含有羰基,本策略主要利用商业可售的一种六重标记的TMT 试剂,其含有aminoxy官能团,能和羰基进行非常高效的标记和捕捉,随后利用抗TMT的抗体树脂进行样品的富集,随后进行质谱鉴定。相对此前利用二甲基化进行一级定量的方式,SiLAP策略步骤简单,TMT的二级定量更准确,同位素标签直接修饰在位点上,也降低了非特异性吸附对鉴定结果的干扰。

       首先,作者利用合成的多肽进行了标记效率的测试,发现37 °C 、 30 min标记效率就接近100%。同时发现TMT标签对肽段的修饰极大提高了肽段在质谱中的信号响应强度,相对于未修饰的同一肽段(ISH*LTGQQAR),被TMT修饰的肽段在MALDI-TOF中提高了40多倍,在LC-ESI-MS中提高了50多倍,极大提高了低丰度修饰肽段的灵敏度,十分有利于对其的鉴定。随后,作者利用对复杂蛋白质组的标记,证明了本方法具有很高的可重复性和定量的准确性。

       接下来,作者就将SiLAP策略用于对蛋白质组中HNE修饰蛋白的鉴定和定量中。作者分别提取了六种干细胞系的蛋白质组,用100 μM HNE in vitro处理4小时,胰蛋白酶酶切后,各用对应的aminooxyTMT标签进行标记,然后按1:1:1:1:1:1进行混合,随后进行富集和质谱鉴定。最终鉴定到1121个蛋白上的2257个HNE修饰位点,为目前最多的HNE修饰蛋白和位点的定量,最多的修饰位点为组氨酸。其中,有101个蛋白在六个细胞系中存在差异性的HNE修饰,其可能和组蛋白结合密切相关,有待进一步研究。

      由于此方法很高的灵敏度,作者还将此策略用于以上六种细胞系内源HNE修饰蛋白的鉴定,鉴定到33个蛋白上33个HNE修饰的多肽。因此,作者认为此方法的高灵敏度、高重复性和高定量准确性有利于后续对HNE修饰的机理研究。

原文作者:CXM







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