蛋白质组学

质谱原理(三)

生命科学被誉为21世纪的最前沿科学之一,随着人类第一张基因序列草图的完成和发展,生命科学的研究也将进入一个崭新的后基因组学,即蛋白质组学时代。正如基因草图的提前绘制得益于大规模全自动毛细管测序技术一样,后基因组研究也将会借助于现代生物质谱技术等得到迅猛发展。本文拟简述生物质谱技术及其在生命科学领域研究中的应用。

1 质谱技术

质谱( Mass
SPectrometry)是带电原子、分子或分子碎片按质荷比(或质量)的大小顺序排列的图谱。质谱仪是一类能使物质粒子高化成离子并通过适当的电场、磁场将它们按空间位置、时间先后或者轨道稳定与否实现质荷比分离,并检测强度后进行物质分析的仪器。质谱仪主要由分析系统、电学系统和真空系统组成。

 
质谱分析的基本原理

 用于分析的样品分子(或原子)在离子源中离化成具有不同质量的单电行分子离子和碎片离子,这些单电荷离子在加速电场中获得相同的动能并形成一束离子,进入由电场和磁场组成的分析器,离子束中速度较慢的离子通过电场后编转大,速度快的偏转小;在磁场中离子发生角速度矢量相反的偏转,即速度慢的离子依然偏转大,速度快的偏转小;当两个场的偏转作用彼此补偿时,它们的轨道便相交于一点。与此同时,在磁场中还能发生质量的分离,这样就使具有同一质荷比而速度不同的离子聚焦在同一点上,不同质荷比的离子聚焦在不同的点上,其焦面接近于平面,在此处用检测系统进行检测即可得到不同质荷比的谱线,即质谱。通过质谱分析,我们可以获得分析样品的分子量、分子式、分子中同位素构成和分子结构等多方面的信息。

质谱技术的发展

质谱的开发历史要追溯到20世纪初J.J.Thomson创制的抛物线质谱装置,1919年Aston制成了第一台速度聚焦型质谱仪,成为了质谱发展史上的里程碑。

最初的质谱仪主要用来测定元素或同位素的原子量,随着离子光学理论的发展,质谱仪不断改进,其应用范围也在不断扩大,到20世纪50年代后期已广泛地应用于无机化合物和有机化合物的测定。

现今,质谱分析的足迹已遍布各个学科的技术领域,在固体物理、冶金、电子、航天、原子能、地球和宇宙化学、生物化学及生命科学等领域均有着广阔的应用。质谱技术在生命科学领域的应用,更为质谱的发展注入了新的活力,形成了独特的生物质谱技术。

2 生物质谱技术

技术的出现使传统的主要用于小分子物质研究的质谱技术发生了革命性的变革。它们具有高灵敏度和高质量检测范围,使得在pmol(10-12甚至fmol(10-15的水平上准确地分析分子量高达几万到几十万的生物大分子成为可能,从而使质谱技术真正走入了生命科学的研究领域,并得到迅速的发展。以下主要介绍与生物医学有关的几项质谱技术。

电喷雾质谱技术

电喷雾质谱技术(Electrospray Ionizsation
MassSpectrometry,ESI-MS)是在毛细管的出口处施加一高电压,所产生的高电场使从毛细管流出的液体雾化成细小的带电液滴,随着溶剂蒸发,液滴表面的电荷强度逐渐增大,最后液滴崩解为大量带一个或多个电荷的离子,致使分析物以单电荷或多电荷离子的形式进入气相。电喷雾离子化的特点是产生高电荷离子而不是碎片离子,使质量电荷比(m/z)降低到多数质量分析仪器都可以检测的范围,因而大大扩展了分子量的分析范围,离子的真实分子质量也可以根据质荷比及电行数算出。

电喷雾质谱的优势就是它可以方便地与多种分离技术联合使用,如液一质联用(LC-MS)是将液相色谱与质谱联合而达到检测大分子物质的目的。

基质辅助激光解吸附质谱技术

基质辅助激光解吸附质谱技术(MatriX AssistedLaser Desorption
/Ionization,MALDI)的基本原理是将分析物分散在基质分子中并形成晶体,当用激光照射晶体时,由于基质分子经辐射所吸收的能量,导致能量蓄积并迅速产热,从而使基质晶体升华,致使基质和分析物膨胀并进入气相。MALDAI所产生的质谱图多为单电荷离子,因而质谱图中的离子与多肽和蛋白质的质量有—一对应关系。

1.电喷雾质谱技术(ESI)[5]
电喷雾质谱技术( Electrospray Ionization Mass Spectrometry , ESI -
MS)
是在毛细管的出口处施加一高电压,所产生的高电场使从毛细管流出的液体雾化成细小的带电液滴,随着溶剂蒸发,液滴表面的电荷强度逐渐增大,最后液滴崩解为大量带一个或多个电荷的离子,致使分析物以单电荷或多电荷离子的形式进入气相。电喷雾离子化的特点是产生高电荷离子而不是碎片离子,
使质量电荷比(m/ z)
降低到多数质量分析仪器都可以检测的范围,因而大大扩展了分子量的分析范围,离子的真实分子质量也可以根据质荷比及电荷数算出。

2.基质辅助激光解吸附质谱技术(MOLDI)[5-7]
基质辅助激光解析电离(MOLDI)是由德国科学家Karas和Hillenkamp发现的。将微量蛋白质与过量的小分子基体的混合液体点到样品靶上,经加热或风吹烘干形成共结晶,放入离子源内。当激光照射到靶点上时,基体吸收了激光的能力跃迁到激发态,导致蛋白质电离和汽化,电离的结果通常是基体的质子转移到蛋白质上。然后由高电压将电离的蛋白质从离子源转送到质量分析器内,再经离子检测器和数据处理得到质谱图。TOF质量分析器被认为是与MALDI的最佳搭配,因为二者都是脉冲工作方式,在质量分析过程中离子损失很少,可以获得很高的灵敏度。TOF质量分析器结果简单,容易换算,蛋白质离子在飞行管内的飞行速度仅与他的(m/z)-1/2成正比,因此容易通过计算蛋白质离子在飞行管内的飞行时间推算出蛋白质离子的m/z值。与传统质量分析器相比,更易得到高分辨率和高测量精度;速度快,离子飞行时间仅为几个μs和约100μs之间;质量范围宽,可以直接检测到几十万道尔顿的单电荷离子。飞行时间质量分析器被认为是21世纪最有应用前景的质量分析器。
3.傅立叶变换-离子回旋共振质谱(FT-ICR MS)[8,9]
傅立叶变换-离子回旋共振质谱法(FT-ICR
MS)是离子回旋共振波谱法与现代计算机技术相结合的产物。傅立叶变换-离子回旋共振质谱法是基于离子在均匀磁场中的回旋运动,
离子的回旋频率、半径、速度和能量是离子质量和离子电荷及磁场强度的函数, 当对离子施加与其回旋频率相同的射频场作用时,
离子将同相位加速到一较大的半径回旋,
从而产生可被接受的类似电流的信号。傅立叶变换-离子回旋共振质谱法所采用的射频范围覆盖了欲测定的质量范围,所有离子同时被激发,
所检测的信号经过傅立叶变换,
转换为质谱图。其主要优点有:容易获得高分辨;便于实现串极质谱分析;便于使用外电离源并与色谱仪器联用。此外,他还有灵敏度高,质量范围宽,速度快,性能可靠等优点。
4.快原子轰击质谱技术(FABMS)
快原子轰击质谱技术( Fast Atom Bomebardment Mass Spectrometry , FABMS)
是一种软电离技术,是用快速惰性原子射击存在于底物中的样品,使样品离子溅出进入分析器,这种软电离技术适于极性强、热不稳定的化合物的分析,特别适用于多肽和蛋白质等的分析研究。FABMS能提供有关离子的精确质量,从而可以确定样品的元素组成和分子式。而FABMS
-MS 串联技术的应用可以提供样品较为详细的分子结构信息,从而使其在生物医学分析中迅速发展起来。
三、蛋白质的分析鉴定[3, 4, 10]
随着质谱技术的发展,分子量的测定已从传统的有机小分子扩展到了生物大分子。MALDI-MS技术以其极高的灵敏度、精确度在蛋白质分析中得到了广泛的应用。该技术不仅可测定各种疏水性、亲水性和糖蛋白的分子量,还可直接测定蛋白质混合物的分子量。这可认为是蛋白质分析领域的一项重大突破。
蛋白质组的研究是从整体水平上研究细胞或有机体内蛋白质的组成及其活动规律。质谱技术作为蛋白质组研究的三大支撑技术之一,除了用于多肽,蛋白质的分子量测定外,还广泛的应用于肽指纹图谱测定及氨基酸序列测定。
肽指纹图谱(Peptide Mass Fingerprinting,
PMF)测定是对蛋白酶解或降解后所得多肽混合物进行质谱分析的方法。质谱分析所得肽断与多肽蛋白数据库中蛋白质的理论肽断进行比较,判断出所测蛋白是已知还是未知。由于不同的蛋白质具有不同的氨基酸序列,不同蛋白质所得肽断具有指纹特征。采用肽指纹谱的方法已对酵母、大肠杆菌、人心肌等多种蛋白质组进行了研究。
对肽序列的测定往往要应用串连质谱技术,采用不同的技术选择特定质核比的离子,并对其进行碰撞诱导解离,通过分析肽段的断裂情况推导出肽序列。
四、后转录修饰的蛋白质的检测和识别
在蛋白质组的研究中,蛋白质和多肽的序列分析已不局限于阐明蛋白质的一级结构,对翻译后的修饰的进一步分析也是蛋白质化学的一项重要任务。这种修饰对于蛋白质的功能非常重要,如:细胞识别中的蛋白质相互作用,信号传导和蛋白质定位。
1. 蛋白质的糖基化[11, 12]
糖蛋白在细胞内部,细胞膜和细胞外均有发现,实际上大部分蛋白质是糖蛋白。对糖蛋白的检测和分析发现,糖蛋白中糖组分的结构和功能具有多样性。糖蛋白中的糖通常是不同种类的,而且是由一些可控数量的单糖组成。糖基化的多样性与细胞周期,细胞分化和发展的状态有关。在蛋白组时代中,蛋白质的修饰会引起其理化性质的改变,因此是不容忽视的。
从1D或2D凝胶得到的糖基化蛋白的识别,一般是进行MALDI-MS指纹分析,
或是对MALDI-PAD或ESI-MS/MS得到的碎片谱进行分析。对完整的糖蛋白的研究是非常困难的,所有已知的离子化技术都有其局限性。目前,人们主要研究糖肽,其好处之一就是质量减小了,这就会得到更好的分辨率,而且糖肽仍保留了糖基化位点。将分离的糖蛋白用不同的蛋白酶消化后就可进行糖肽的研究。一旦糖肽被识别出,就可以用串连质谱(ESI-MS/MS)来阐明肽序列。当蛋白的序列已知时,计算质量差就可推出其上附着的寡糖的质量。
要将糖部分从糖蛋白中释放出来,可用化学切割或酶切割(流程图见图1)。目前,连有结构专一性糖苷酶的质谱在提供序列,分支和链接数据方面是最有力的技术。对于N糖基化常用的糖苷内切酶有PNGase-F,
PNGase-A,
EndoF和EndoH。化学切割也可以用来释放O-连接和N-连接的多糖,但经常出现的缺点是他会完全破坏所有的肽键,因而丢失了关于糖附着位点的信息。而且这些切割不能从糖肽中连续释放单糖。用肼的化学切割可以除去两种类型的糖基化。在60℃可专一性的释放O-连接的糖,而在95℃能释放N-连接的糖。释放O-原子更常用的方法是用碱进行β消除。通常,糖基中加入金属离子在MALDI和ESI中离子化。用MALDI-MS分析糖类的一个好的选择是将之与其他一些化合物混合,这样可以进一步提高灵敏度和分辨率。不同的质谱方法可以产生多糖的源后裂解(PSD)和碰撞诱导解离
(CID)谱,这可以给出有关糖的序列,分支及糖间的连接等信息。
2. 蛋白质的磷酸化[13, 14]
蛋白质中氨基酸的磷酸化在生命系统中起重要的作用。磷酸化经常作为分子开关控制不同过程蛋白质的活性,如新陈代谢,信号传导,细胞分裂等过程。因此,蛋白质中磷酰氨基酸的识别在蛋白质分析中是一项重要的工作。已知的磷酰氨基酸的类型有四种:
1.O-磷酸盐,通过羟氨酸的磷酸化形成的,如丝氨酸,苏氨酸,酪氨酸。
2.N-磷酸盐,通过精氨酸,赖氨酸或组氨酸中的氨基的磷酸化形成的。
3.乙酰磷酸盐,通过天冬氨酸或谷氨酸的磷酸化形成的。
4.S-磷酸酯,通过半胱氨酸的磷酸化形成的。
用质谱分析磷酸化时主要存在的问题是,混合物中磷酸化肽的信号被抑制。因此只有当一些非磷酸化肽的含量降低(或磷酸化的肽被富集)后,
分析磷酸化的肽才会变得容易些。一些相应的用于质谱分析的前磷酸化肽或磷酸化蛋白质的分离和富集方法和技术已有所发展,现已建立的分离技术有:双向磷酸多肽谱图(2D-PP),高分辨率的凝胶电泳(2DE)和反相高效液相色谱(RP-HPLC)。对于32P标记的磷酸化肽或蛋白可用放射自显影或磷储屏检测,提取后可以高灵敏度MALDI-MS分析;如果32P标记不可行,就要用LC-MS/MS分析,常用HPLC与质谱联用。
常用的富集方法有:固定金属亲和色谱(IMAC),IMAC是选择性分离和富集磷酸化肽最广泛的方法。此方法中,
键合在螯合底物上的金属离子(通常是Fe3+或Ga3+)选择性地与磷酸化肽中的磷酸部分相结合,
并且在高pH
或磷酸缓冲液中磷酸化肽可以释放出来。抗体免疫沉淀,高亲和性抗体可以从复杂混合物中免疫沉淀特定的蛋白。目前利用抗体富集蛋白/肽仅局限于分析磷酸化酪氨酸,
然后用MALDI-TOF MS分析与抗体相联接的磷酸化肽。尽管用于免疫沉淀的抗体对其底物必须有相对高的亲和力,
但低亲和力抗体仍然可以有效地用于免疫印迹Western-blotting分析。化学修饰,已建立了两种从复杂混合物中专一分离磷酸化蛋白/肽的方法[15,16]。但两种方法都有待进一步优化以鉴定低丰度蛋白质。
磷酸化肽的检测和磷酸化位点的确定主要有以下MS技术:MALDI-TOF MS
可以通过肽指纹谱(PMF)鉴定蛋白质,与磷酸酯酶处理相结合可以确定磷酸化位点。其原理是磷酸酯酶处理后,磷酸化的肽丢失磷酸基团而产生特定质量数的变化,MALDI-TOF
MS通过检测这种质量数的变化而确定磷酸化位点。串联质谱(MS/MS)
可进行前体离子扫描,这一方法是通过检测磷酸基团产生的特定片段来报告磷酸肽的存在。磷酸化肽经CID后会产生磷酸基团的特异性片段,这些特异性的片段在用串联质谱进行前体离子扫描时可作为磷酸肽的“报告离子”。串联质谱还可进行中性丢失扫描,这种方法是用MS/MS检测经CID后发生中性丢失H3PO4
(98 u)的肽段。另外,由于液相色谱分离肽降低了离子抑制效应,也有人用LC-MS/MS分析磷酸化位点。傅立叶变换质谱进行电子捕获解离
电子捕获解离(ECD)与傅立叶变换离子回旋加速共振(FTICR)质谱相连是蛋白质、肽测序和研究蛋白质翻译后修饰的一个有力方法。近来,它已被成功地用于鉴定肽片段上发生磷酸化的残基。

五、
小结
目前,生物质谱被认为是大规模、高通量进行蛋白结构鉴定的首选工具,但与之结合的2-D电泳仍有缺点,如工作量大,重现性差。因此,将对其进行改进,如分子扫描技术等。由于通过LC-MS/MS可直接鉴定蛋白混合物,因此将来有望不通过2-D
就能研究蛋白质组。当然,这还需要解决一些技术问题,其中最根本的是质谱的定量问题。生物质谱的魅力在于它能帮助我们研究蛋白-
蛋白间相互作用、翻译后修饰乃至基因表达水平的变化等。相信,随着生物质谱技术和数据采集软件技术的不断飞速发展,我们将能够获得这方面的更多信息,从而揭示出生命活的奥秘。







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