蛋白质组学

基于质谱的蛋白质鉴定,第2节:蛋白质电泳和Edman降解法测序

蛋白质电印迹是基于蛋白质免疫印迹法(Western blotting, WB)的蛋白质转印法,但蛋白质电印记法使用固定化的膜,固定膜可抵抗蛋白质和肽序列进入测序仪之后的化学反应步骤。 由于其操作简便,设备成本低以及与基于Edman降解法测序仪的兼容性,蛋白质电印迹法被广泛用作蛋白质微量样品的制备。PVDF膜也替代了初代使用的多碱涂层或四分之一玻璃纤维纸,成为最佳选择。如今PVDF膜为了实现最高的转印效率,可对多种不同的参数(印迹条件,膜类型)进行选择,如具有高蛋白结合能力(100±200 mg / cm2),可以通过常规蛋白染色程序等类型。

带有目标蛋白点的膜被切下来,进行进一步的分析。可以通过测序仪进行蛋白质N端测序,也可以将结合的蛋白从膜上洗脱下来,进行序列分析。使用直接印迹法测序,鉴定出的残基数量一般不会超过三十个循环。而且,当对极少量蛋白质样品进行测序时,在苯基硫代乙内酰脲氨基酸(Ser,Thr,Arg,His)等低丰度氨基酸残基或修饰残基的位置经常会遇到问题。此外,蛋白质N末端在生物合成过程中(乙酰化,甲酰化或焦谷氨酰基形成),经常会被封闭。随着分析蛋白质的数量减少,科学家们很难对经常注意到的不同类型的N末端阻滞进行解释。科学家们推测是由于与缓冲液中存在的痕量化合物发生反应,或由未完全聚合的凝胶中存在的游离氨基与游离丙烯酰胺反应引起的。这也归因于蛋白质功能基团和用于检测蛋白质的染色剂之间的相互作用。由于这些限制,也因为N端测序是一项只有一次机会的试验,不能对已经上机的样品进行二次检测。于是Aebersold等提出了原位裂解的策略。在原位裂解法中,固定的蛋白质用特定的蛋白酶(例如胰蛋白酶,内切蛋白酶Asp-N或内切蛋白酶Lys-C)消化。在消化后的混合物中,最亲水的肽会从膜上解离,可以通过窄孔或微孔反相液相色谱对其进行分离。从而可以对每种纯化得到的短肽进行单独测序。这种方法比直接的N端测序灵敏度低(由于需要额外的步骤),但是它能够绕过蛋白质阻滞和生成目标蛋白质内部序列的多个片段的优势,为选择不同的序列和提高蛋白鉴定打分提供了条件。

除原位消化外,蛋白质裂解还可以在凝胶中进行,凝胶内的肽混合物通常会带有来自凝胶本身或染色剂中的杂质。也有研究认为当结合的蛋白质含量低于一定水平(通常估计为10 μg蛋白质/ cm2)时,原位消化可能会失败。当单个斑点中蛋白质含量不足时,可以通过将凝胶中的样品进行合并后,重新洗脱蛋白质,然后重新浓缩的方法解决这一问题。

基于Edman降解法的方法通常速度较慢,因为每个蛋白质斑点或肽峰都必须进行单独测序。在这些情况下,很难实现高通量分析。尽管如此,第一个2-D凝胶蛋白数据库是以Edman降解测序获得的。它通过算法将获得的蛋白序列与数据库中的序列信息进行比对,实现蛋白质的鉴定。通过对算法的不断改进,近代随着算法的容错率大大增加,能够实现仅仅具有相识性就能对蛋白质进行识别,而且还能在给定物种的相同家族成员数据之间进行比对。在这些研究中,蛋白质组学所基于的所有基本原理都得以使用。当开始大规模基因组测序并伴随着生物质谱分析能力的不断提高时,这个“静止”状态的学科开始活跃起来。通过两种科学方法的结合,从大规模蛋白质组学的角度进行思考变得现实。而这一切,都得益于基于MALDI技术的发展,下一节开始将对围绕MALDI技术进行详细介绍。

北京百泰派克公司采用高分辨率质谱平台技术,包括Thermo Fisher的Q Exactive质谱仪,LTQ Orbitrap Velos质谱仪,以及AB SCIEX的6500 Q TRAP质谱仪,结合 Nano-LC高通量液相色谱技术,能够对SDS-PAGE蛋白条带、2D蛋白胶点等样品中的蛋白质进行高效精准鉴定。胶条、胶点蛋白质谱鉴定服务可保证100%的鉴定率,否则不收任何费用。







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