蛋白质组学

生物化学笔记02

内容提要:

1、氨基酸与蛋白质

氨基酸分类:常见蛋白质氨基酸,不常见蛋白质氨基酸,非蛋白氨基酸;氨基酸的酸碱化学,氨基酸两性解离,氨基酸的等电点;氨基酸的旋光性和紫外吸收。

蛋白质的共价结构:蛋白质的化学组成和分类,蛋白质功能,蛋白质的形状和大小,蛋白质构象和组织层次。

肽:肽键结构,肽的物理化学性质,活性多肽。

蛋白质一级结构测定:Sanger试剂,DNS及Edman降解,二硫桥位置确定。

蛋白质的三维结构:XRD原理;稳定蛋白质三维结构的作用力,肽平面和两面角;蛋白质的二级结构:α-螺旋,β-折叠片,β-转角;超二级结构和结构域;球状蛋白的三级结构;亚基缔合和四级结构。

蛋白质结构与功能的关系:肌红蛋白和血红蛋白的结构与功能,镰刀状细胞贫血病;免疫球蛋白。

蛋白质的分离、纯化和表征:蛋白质分子量测定,沉降分析及沉降系数,沉降系数单位,凝胶过滤及SDS-PAGE法测分子量;蛋白质的沉淀;电泳:区带电泳、薄膜电泳、等电聚焦电泳、毛细管电泳。

2、酶和辅酶

酶催化作用特点:反应温合、高效、专一、可调节控制;酶活性调节控制:调剂酶浓度、激素调节、反馈抑制调节、抑制剂激活剂调节、别构调控、酶原激活,可逆共价修饰;酶的化学本质及其组成,辅酶和辅基,单体酶,寡聚酶和多酶复合体。

酶的命名和分类:习惯命名法;国际系统命名法及酶的编号,六大类酶的特征。

酶的专一性:“锁与钥匙”学说;诱导楔合假说;过渡态理论,过渡态类似物与医药和农药的设计,催化抗体。

酶的活力测定:酶活力单位,比活力。

酶工程:化学修饰酶,固定化酶,人工模拟酶。

酶促反应动力学:底物浓度与酶反应速度,酶促反应动力学方程式及推导,米氏常数的意义和求法。

酶的抑制作用:不可逆抑制和可逆抑制及动力学判断,一些重要的抑制剂,有机磷农药和磺胺药作用机制。

温度、PH、激活剂对酶反应影响。

酶的作用机制:酶活性部位及研究方法;影响酶催化效率的有关因素:临近和定向效应、底物形变和诱导契合、酸碱催化、共价催化、金属离子催化、多元催化和协同效应、微环境影响;溶菌酶作用机制和胰凝乳蛋白酶。

辅酶的结构与活性部位:vit.B1和TPP,维生素PP和辅酶Ⅰ、辅酶Ⅱ,vit.B2和黄素辅酶,泛酸与辅酶A,vit. B6及其磷酸酯,vit. B12,生物素,叶酸,硫辛酸。

3、氨基酸代谢

氨基酸的脱氧、转氨和联合脱氨基作用,氨基酸脱羧基作用。

尿素的形成:氨的转运和尿素循环。

氨基酸碳骨架的氧化途径,生酮氨基酸和生糖氨基酸。

由氨基酸衍生的生物活性物质:氨基酸与一碳单位,酪氨酸及儿茶酚胺类物质,色氨酸衍生物,组胺,牛磺酸。

4、氨基酸及其重要衍生物的生物合成

必需氨基酸;氨基酸的生物合成。

氨基酸几种重要衍生物:NO的形成,谷胱甘肽,肌酸,血红素,胆红素。

5、糖代谢

糖的生物学作用:糖的结构特点和糖工程。

糖酵解作用:酵解和发酵,酵解全过程和反应步骤;酵解过程中能量转变的估算;丙酮酸去路。

柠檬酸循环:丙酮形成乙酰CoA,柠檬酸循环概貌和反应步骤;柠檬酸循环的化学总结算。

生物氧化— 电子传递和氧化磷酸化:氧化还原电势;电子传递和氧化呼吸链,电子传递抑制剂;氧化磷酸化作用,化学渗透假说,氧化磷酸化解偶联和抑制剂。

 戊糖磷酸途径及生理意义;葡糖异生作用及途径;糖原的分解与生物合成。

6、脂质和生物膜

脂质:脂肪酸结构特点,必需多不饱和脂肪酸。

磷脂:甘油磷脂,卵磷脂,脑磷脂,磷脂酰丝氨酸,磷脂酰肌醇,磷脂酰甘油,缩醛磷脂;鞘磷脂,鞘氨醇和神经酰胺。

糖脂:脑苷脂,神经节苷脂。

类固醇,胆固醇。

生物膜的组成与性质:膜脂,胆固醇对膜流动性的调节作用;膜蛋白功能和糖的细胞通信作用;生物膜分子结构的作用力和主要特征。

生物膜与物质运输:被动运输与主动运输,钠钾泵,生物大分子跨膜运输。

人工模拟膜:模拟膜的功能;模拟膜主要类型:LB膜,BLM和脂质体

7、核酸

核酸研究进展:生物技术的兴起,转基因产品,基因工程,基因芯片,人类基因组计划。

核酸的种类和生物功能。

核酸的结构:碱基、核苷与核苷酸;核酸的共价结构,DNA双螺旋结构,DNA的拓扑异构,DNA的四级结构;mRNA、tRNA和rRNA的高级结构。

核酸的物理化学性质:核酸的酶水解和核酸的酸碱性质,核酸的紫外吸收。

核酸的变性,复性及杂交。

8、核酸的降解

核酸和核苷酸的分解代谢:嘌呤碱的分解,痛风病起因及别嘌呤醇作用机制;

嘧啶碱的分解。

核苷酸的生物合成:嘌呤核糖核苷酸的从头合成及补救途径,抗癌和杀菌剂作用原理;嘧啶环的合成;脱氧核糖核苷酸的合成,5-Fu和氨甲喋呤的抗癌作用机制。

9、DNA的复制和修复

DNA的复制:DNA的半保留复制,复制叉;DNA聚合酶及DNA聚合要素,DNA连接酶和拓扑异构酶。

DNA半不连续复制和冈崎片段;DNA复制的起始、延伸和终止;DNA复制的复杂性。

DNA损伤修复:错配修复,直接修复,切除修复,重组修复和应急反应。

10、RNA的生物合成和加工

DNA指导的RNA合成,RNA聚合酶,不对称转录;启动子和转录因子,终止子和终止因子;转录的调节控制,操纵子模型;转录反应四阶段。

RNA生物合成的抑制剂:嘌呤和嘧啶类似物,DNA模板功能抑制物,RNA聚合酶抑制剂。

RNA转录后加工:原核生物中RNA的加工,真核生物RNA的加工,RNA拼接、编辑和再编码,酶性核酸;RNA生物功能多样性。

在RNA指导下RNA和DNA的合成:RNA复制和RNA病毒复制的重要方式,RNA的逆转录和逆转录酶。

11、蛋白质生物合成

遗传密码:三联密码,遗传密码的基本特性。

蛋白质合成及转运:m-RNA是蛋白质合成的模板,t-RNA转运氨基酸,核糖体是蛋白质合成的工厂。翻译的步骤。

蛋白质运输及翻译后修饰。

12、 基因工程

DNA克隆的基本原理:DNA限制酶和连接酶,克隆载体与宿主系统,外源基因导入宿主细胞,分离筛选及克隆;基因文库和c DNA文库。

聚合酶链式反应:PCR基本原理,最适条件和发展应用。

DNA序列的测定

第一章  氨基酸与蛋白质  上册  P123

1. 1  氨基酸

(一)蛋白质水解最后成为氨基酸混合物

酸水解  得19种 L-AA,色氨酸破坏。

碱水解  得色氨酸,其余氨基酸消旋破坏。

酶水解  不消旋破坏,但水解不彻底。

(二)α­­-氨基酸的一般结构

生物体内已发现氨基酸180种,常见氨基酸20种

1. 2  氨基酸的分类:常见蛋白质氨基酸,不常见蛋白质氨基酸,非蛋白氨基酸

(一)常见蛋白质氨基酸,或称基本氨基酸。每个氨基酸可用三个字母或单字母简写表示。按侧链R基不同进行分类。

(1)  按R基化学结构分类

1.  脂肪族氨基酸15个

①.中性氨基酸5个

甘氨酸  Glycine  氨基乙酸  Gly   G  无旋光

丙氨酸  Alanine  α­­-氨基丙酸  Ala  A

缬氨酸  Valine  α­­-氨基-β-甲基丁酸  Val  V

亮氨酸  Leusine  α­­-氨基-γ-甲基戊酸  Leu  L

异亮氨酸  Isoleucine  α­­-氨基-β-甲基戊酸  Ile  I

②.含羟基或硫氨基酸4个

丝氨酸  Serine  α­­-氨基-β-羟基丙酸  Ser  S

苏氨酸  Threonine  α­­-氨基-β-羟基丁酸  Thr  T

半胱氨酸  Cysteine  α­­-氨基-β-基丙酸  Cys  C

甲硫氨酸  Methionine  α­­-氨基-γ-甲硫基丁酸  Met M

  ③.酸性氨基酸及其酰胺4个

天冬氨酸  Aspartic acid  α­­-氨基丁二酸  Asp  D

谷氨酸  Glutamic acid  α­­-氨基戊二酸  Glu  E

天冬酰胺  Asparagine  α­­-氨基丁二酸一酰胺  Asn  N

谷氨酸胺  Glutamine  α­­-氨基戊二酸一酰胺  Gln  Q

④. 碱性氨基酸2个

赖氨酸  Lysine  α,ε-二氨基已酸  Lys  K

精氨酸  Arginine  α­­-氨基-δ-胍基戊酸  Arg  R

2.  芳香族氨基酸3个

苯丙氨酸  Phenylalanine  α­­-氨基-β-苯基丙酸  Phe  F

酪氨酸  Tyrosine  α­­-氨基-β-对羟苯基丙酸  Tyr  Y

色氨酸  Tryptophan  α­­-氨基-β-吲哚基丙酸  Trp  W

3.  杂环族氨基酸2个

组氨酸  Histidine  α­­-氨基-β-咪唑基丙酸  His  H

脯氨酸  Proline  α­­-吡咯烷羧酸  Pro  P

(2)  按R基极性性质分类

1.  非极性R基8个

Ala(A)  Val(V)  Leu(L)  Ile(I)  Pro(P) 

Phe(F)  Trp(W)  Met(M)

2.  极性不带电R基7个

Gly(G)  Ser(S)  Thr(T)   Cys(C)  Tyr(Y)

Asn(N)  Gln(Q)

3.  带正电荷R基3个

Lys(K)  Arg(R)  His(H)

4.带负电荷R基2个

  Asp(D)  Glu(E)

另外  Asx(B):Asp(D),Asn(N)

  Glx(Z): Glu(E),Gln(Q)

两个Cys常氧化形成胱氨酸Cystie

(二)不常见蛋白质氨基酸  P128

为相应常见氨基酸修饰而来,如:5-羟赖氨酸,4-羟哺氨酸,γ-羧基谷氨酸,焦谷氨酸,磷酸丝氨酸,甲状腺素等。

(三)非蛋白氨基酸  P129

1.  L型α-氨基酸衍生物  P128

2.  β、γ或δ-氨基酸

3.  D-氨基酸,如D-Glu和D-Ala

常见有:肌氨酸(N-甲基甘氨酸),β-丙氨酸,γ-氨基丁酸,瓜氨酸,鸟氨酸,高半胱氨酸。

1.3 氨基酸的酸碱化学

(一)氨基酸两性解离

  -H+  -H+ 

  A+  A0  A-

(质子供体)  +H+  +H+  (质子受体)

 Ka1 = [A0] [H+]/ [A+]  pH=pKa1+lg[A0]/ [A+]

 Ka2=[A-][H+]/[A0]  pH=pKa2+lg[A-]/[A0]

综合pH=pHa+lg[质子受体]/ [质子供体]

由此 1.由pH值 、AO/A+或A-/A0测pKa

  2.pKa为常数, 由pH计算A0/A+或A-/A0

3.由[质子受体]/ [质子供体]可计算pH

(1)氨解酸的pKa测定

甘氨酸解离曲线  P131  图3-9

1 mol Gly溶于水,溶液pH=6.0

用1 mol NaoH溶液滴定得曲线B,消耗0.5mol时,在pH9.6处有一拐点,此时[A0]= [A-]  pH=pKa2  测出pKa2=9.6

用1 mol Hcl滴定得曲线A,当消耗0.5 mol HCl时得一拐点,pH=pKa1  测出pKa1=2.34

带有可解离R基的氨基酸相当于三元酸,有三个pKa值,Glu和Lys滴定曲线见  P132  图3-10

(二)等电点

氨基酸或其他带电颗粒处于净电荷为零的兼性离子状态时介质的pH值,用pI表示,又称等电pH。

对于Gly ,pI=5.97,为曲线A和曲线B之间的拐点,Gly为兼性离子,净电荷为零。

等电点pH值计算:

pI=1/2(pKa+­)+pKa)

Gly  pI=1/2(2.34+9.60)=5.97

对于带可解离R基的氨基酸 如Asp的pKa,pKa1=2.09  pKa2=3.86  pKa3=9.82

等电点  pIP=1/2( pKa+pKa2)=1/2(2.09+3.86)=2.98

同理推出  Lys  pI=9.74

P133  表3-3列出20种氨基酸的pKa值和pI可做常数用,其中七个氨基酸R基有pKa值。

1.  4 氨基酸的光学性质

(一)旋光性  一个无旋光  Gly  17个含一个不对称碳原子,两个含两个不对称碳原子  Thr和Ile,有四种光学异构体。

  胱氨酸分子内部对称有内消旋体,有三种异构体。

  比旋光为氨基酸物理常数之一,但随pH值变化常见氨基酸比旋光度可用来鉴别氨基酸,P144表 3-4

(三)氨基酸的紫外吸收

  λmax(nm)  ε(摩尔消光系数)

  Phe  257   2.0×102

  Tyr  275  1.4×103

  Tvp  280  5.6×103

  蛋白质在280nm波长下测光吸收,光吸收值越大,相对纯度越高,常用在蛋白质提纯过程。

1.5 蛋白质的共价结构

(一)蛋白质  氨基酸首尾相连形成蛋白质。

平均含氮量为16%

蛋白质含量 = 蛋白氮×6.25

 从细菌到人类所有物种的蛋白质都由这一组20种氨基酸构成。

1.  单纯蛋白质:仅由氨基酸组成,如核糖核酸酶,肌动蛋白等。见P158

  表 4-1。

2.  缀合蛋白质:除氨基酸外,还有非蛋白部分,称为辅基或配基,如血红蛋白、核蛋白、糖蛋白、脂蛋白等,见P158 表 4-2。

(二)蛋白质功能

生物界蛋白质种类估计有1010~1012种,20种氨基酸全排列为Anm=2020。

1.  催化(酶):生物体内化学反应几乎都是在酶催化下进行的。

2.  调节:基因表达调控中的蛋白因子,阻遏蛋白和激素中许多为蛋白质,如胰岛素等。

3.  转运:血红蛋白输氧气,细胞色素C传递电子。

4.  贮存:如种子中谷蛋白,蛋中卵清蛋白。

5.  运动:肌动蛋白,驱动蛋白。

6.  结构:胶原蛋白,α-角蛋白。

7.  信息传递:受体蛋白。

8.  防御和进攻:免疫球蛋白,毒蛋白如蛇毒。

9.  异常蛋白:胶质蛋白。

(三)蛋白质的构象

为蛋白质具有的特有空间结构或称三维结构。在生理条件下,蛋白质只有一种或很少几种构象在能量上是有利的。

  功能来自构象:

  为表达蛋白质结构上不同组织层次,一般采用下列专门术语:

1.  一级结构:又称化学结构,指蛋白质多肽链氨基酸连接在一起的顺序,包括二硫键位置,为共价键连接的情况。

2.  二级结构:多肽链借助氢键排列成自己特有的α-螺旋和β-折叠片段(P161  图4-1),这些片段构成规则结构,并沿一维方向伸展。

3.  三级结构:由二级结构元件(α-螺旋,β-折叠等)构造成的总三维结构,包括一级结构中相距远的肽段之间的几何相互关系和侧链在三维空间中彼此间相互关系。

4.  四级结构:寡聚蛋白质中各亚基之间在空间上的相互关系和结合方式。

  寡聚蛋白是由两条或多条多肽链构成,其中每条多肽链称为亚基或亚单位。

 1.6  肽:P162

肽为氨基酸的线性聚合物,蛋白质是由一条或多条多肽链构成。

(一)肽和肽键结构

肽的命名从N端开始到COOH端,氨基酸残基按顺序从左向右写,-NH2末端在左,-COOH端在右。如Ser-Gly-Phe,称为:丝氨酰甘氨酰苯丙氨酸。

一般氨基酸数目 12~20的肽为寡肽(小肽); 20的肽为多肽。

(二)肽的物理化学性质

(1)  与氨基酸同,为离子晶格,熔点高,在水溶液中以偶极离子存在。多肽中酰胺的氢不易解离,肽的酸碱性质主要取决于游离末端的α-氨基和α-羧基,以及侧链R基上的可解离基团,如Glu的γ-COOH、Lys的ε-NH2。

(2)  滴定曲线:也有等电点,为多价离子等电点。以Gly-Glu-Lys-Ala四肽为例 (P166表4-6):

①当pH 3.5,末端可解离基团质子化,2个+NH­3、2个COOH,净电荷 +2;

②pH 3.5-4.5,C-末端COOH解离(pKa­=3.7),为2个+NH3、一个COOH、一个COO-,净电荷+1;

③  pH 4.5~7.5,Glu的γ-COOH解离,2个+NH3、2个COO-(pKa=4.6),为等电点,净电荷为0;

④pH7.8~10.2,N末端-+NH3解离(pKa=7.8),一个+NH3、 一个NH2 、2个COO-、净电荷-1;

⑤  pH 10.2,ε-+NH3解离,2个NH2、2个COO-,净电荷-2。

pH在等电点以上(碱性),多肽带负电荷。

pH在等电点以下(酸性),多肽带正电荷。

蛋白质滴定曲线更加复杂。

(3)  化学反应

① 与茚三酮在弱酸性溶液中共热显紫色,为α-NH2反应(注意:伯胺也可使茚三酮显紫色),氨基酸、多肽均有此反应。Pro为仲胺(亚氨基氨基酸),与茚三酮生成黄色物质。

茚三酮反应可用于定性、定量测定氨基酸和多肽。

② 肽键的双缩脲反应:多肽,蛋白质中有肽键,有此反应,氨基酸没有此反应。双缩脲:H2N-CO-NH-CO-NH2  ,P163。

  双缩脲反应:含有两个或两个以上肽键的化合物(如双缩脲或二肽以上等多肽)在碱性溶液中能与CuSO4生成紫红色或紫蓝色复合物,可定性或定量测定蛋白质含量,颜色深浅与蛋白质浓度成正比。

(三)活性多肽:

动植物体内存在许多具有生理活性的多肽,多肽药物已获得人们的重视。

二肽:肌肽 β-Ala-His,抗氧化,抗自由基,消炎,调节免疫。

甜二肽 Aspartame  Asp-Phe-OCH3,比蔗糖甜200倍。

  三肽:谷胱甘肽 γ-Glu-Cys-Gly,维持红细胞及其蛋白质中Cys的-SH处于还原态。

  四肽:促胃酸激素。

  五肽:脑啡肽,内源性吗啡,与吗啡受体结合。

  蛋氨酸脑啡肽  TyrGlyGlyPheMet。

  亮氨酸脑啡肽  TyrGlyGlyPheLeu。

  八肽:α-鹅膏蕈碱,见P168 图4-6,剧毒毒素。

  九肽:牛催产素,牛加压素(升高血压),见P167,两者只差两个氨基酸,但生理作用极不相同。

  十肽:短杆菌肽,见P532,为抗生素。

  促黄体生成激素释放因子,见P551,为激素。

  十六肽:内啡肽,有镇痛作用。

  二十四肽:促皮质素(ACTH),治关节炎,已商品化。

  二十六肽:蜂素溶血肽,抗关节炎。

  五十一肽:胰岛素,降血糖。

以活性多肽研究为基础的药物研究:

血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂(ACEI)的开发是近代高血压治疗史上

的重大进展。

人体内存在的血管紧张素Ⅰ(AngⅠ)为十肽,无活性,但在ACE作用下

转化为血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)为八肽,具有收缩血管平滑肌作用,使血压升高。

   ACE

  DRVYIHPFHL(AngⅠ)  DRVYIHPF(AngⅡ)。

ACEI可使ACE失活,使AngⅠ不能形成AngⅡ,从而降血压,研究Ang

Ⅰ活性部位,作用机理,进而设计并合成ACEI,已开发出二十多种降压药物,

如巯甲丙脯酸(Captopril)、依那普利(Enalapril)、赖诺普利(Lisonopril)等。

1.7  蛋白质一级结构测定 :P168

测定蛋白质中共价键连接的情况,包括存在的链内、链间的二硫键位置,氨基酸数目、类型和顺序。

蛋白质氨基酸顺序决定其三维结构,而三维结构决定其生物活性和功能。蛋白质中氨基酸顺序是由基因决定的,是联系DNA遗传信息和蛋白质生物功能的桥梁。

蛋白质中氨基酸顺序揭示其进化史,具有同一祖先的蛋白质才有相似的氨基酸顺序。如细胞色素C(P182),是一种含血红素的电子转运蛋白,存在于所有真核生物的线粒体中。40多种物种的细胞色素C序列的研究揭示,在细胞色素C中含有的一百多个氨基酸残基,其中有28个位置上的氨基酸残基是相同的(P182 图4-16),这些不变残基对于细胞色素C的生物学功能至关重要,由此可根据细胞色素C序列的物种差异建立进化树(P183 图4-17)。来自任两个物种的细胞色素C间序列的氨基酸差异数目越多则进化位置相差越远。

(一)蛋白质测序

样品纯度应 97%,测分子量(允许误差10%)。

1.  蛋白质分子中多肽链的数目:测N-末端和C-末端残基的摩尔数。寡聚蛋白要用变性剂将亚基拆开。

2.  每一多肽链氨基酸组成:鉴定N-末端残基和C-末端残基,定出氨基酸序列参考点。

3.  按专一方式断裂成较小的肽片段:可用酶或化学方法完成,并用多种断裂方法,将每条多肽链样品降解成几套有重叠序列片段的肽段。

4.  侧各肽段氨基酸序列:常用Edman降解法,用自动序列分析仪。

5.  测定片段次序:用重叠肽段确认拼凑出原来完整多肽链的氨基酸序列。

6.  确定二硫键位置。

(二)N-末端和C-末端氨基酸残基的鉴定

 (1)N-末端分析

①  二硝基氟苯(DNFB或FDNB)法:Sanger反应。

2、4-二硝基氟苯称为Sanger试剂,与游离末端氨基反应生成DNP-多肽或DNP-蛋白质,再酸性水解生成DNP-氨基酸(黄色),提取分离后可进行鉴定和定量测定。

此方法在蛋白质氨基酸序列分析的历史上起过很大作用。

②  丹磺酰氯(DNS)法:有荧光,灵敏度高。5-二甲氨基-萘-1-磺酰氯(DNS),结构式见170。

③  Eman降解

苯异硫氰酸酯 (PITC) 法:Phenylisothiocyanate(PITC)能顺序从肽的N-端将氨基酸残基一个个切下来,还可用来测定氨基酸序列。

PITC与多肽链每反应一次,得到一个PTH-氨基酸和少一个氨基酸残基的肽。

PTH (phenylthiohydantoin): 苯乙内酰硫脲。PTH-氨基酸可用TLC或HPLC快速测定,由此发展出氨基酸序列自动分析仪。

④  氨肽酶法:

用外切酶,从N-末端逐个向里切。最常用的是亮氨酸肽酶,适用于N-末端残基的氨基酸被封闭的肽(如环肽);N-末端是焦谷氨酸残基时,可使用焦谷氨酸氨肽酶。

(2)C-末端分析

① 肼解法:蛋白质或多肽与无水肼加热发生肼解反应,除C-末端氨基酸以游离形式存在外,其余氨基酸都变成相应的氨基酸酰肼化物。肼进攻肽键而不易与-COOH反应,肼解中Gln、Asn、Cys被破坏。

② 还原法:用LiBH4还原C-末端氨基酸成氨基醇,肽水解后可分离、鉴定。

③ 羧肽酶法:专一地从肽链C-末端开始逐个降解释放出游离氨基酸,P171图4-7。

(三)二硫键断裂:

  用变性剂,如8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍使蛋白质变性,分子内部-S-S-露出,并用HSCH2CH2OH处理,则-S-S-变成2个-SH,再用碘乙醇保护-SH不被氧化,P172 图 4-8。

  也可用过甲酸氧化,将-S-S-变成2个磺酸基。

(四)氨基酸组成分析:

可用氨基酸分析仪进行测定。样品可用酸完全水解(6mol/L HCl),再用碱水解测Trp。

测出Asx和Glx,酰胺基总量由水解液中NH4Cl量计算出。

P172 表4-8列出一些蛋白质的氨基酸组成。

(五)多肽链部分裂解成小肽段,分别测序:

现在一般只能测几十个氨基酸残基肽段,需将蛋白质先裂解成较小肽段,分离后测序。

(1)   酶裂解法:常用的蛋白酶有以下几种(为内切酶):

  胰蛋白酶:水解碱性氨基酸的羧基所形成的肽键,如Lys,Arg。

  糜蛋白酶(胰凝乳蛋白酶):肽键羧基端为芳香族氨基酸,如Phe、Trp、或Tyr,以及疏水氨基酸Leu、Met或His。

  胃蛋白酶:特异性不太强,切点多,肽键羧基端为芳香族和疏水氨基酸。

(2)  化学裂解法:溴化氰BrCN断裂羧基端为Met的肽键,反应见P175 图4-10,生成肽酰高丝氨酸。

(六)肽段氨基酸序列测定

(1)  Edman化学降解法:

每反应一次生成一个PTH-AA,层析分离、鉴定,剩下减少一个残基的肽链,又有新N-端参加下一轮反应。由此进行氨基酸序列自动分析,进行几轮反应就能测出几个残基序列。最低样品用量仅5 pmol。

  Edman降解现已有多种改进。如DNS-Edman测序,可提高灵敏度;试剂的改进,用由荧光基团或有色基团标记的PITC可更灵敏。

(2)  质谱法:电喷射电离(ESI),见P178 图4-11。使蛋白质离子解吸进入气相,15肽以下均可用。

(七)肽段在多肽链中次序确定

用两种或两种以上不同方法断裂多肽样品成两套或几套肽段,由于切口错位,可由重迭肽(两套肽段相互跨过切口而重迭的肽段)确定肽段先后次序,从而拼凑出整个多肽链的氨基酸序列。P179 图4-12。

(八)二硫桥位置的确定

用切点多的胃蛋白酶水解肽链,生成比较小的含二硫桥的肽段混合物,将样品点在滤纸中央,在pH6.5进行第一向电泳分离。然后用过甲酸蒸气熏,-S-S-氧化断裂成两个含磺酰丙氨酸(带负电荷)的肽。将滤纸转900,在完全相同条件下再进行第二向电泳,大多数肽段迁移率未变,位于滤纸对角线上,而含磺酰丙氨酸的肽段由于负电荷增加偏离对角线(向正极向),见P178 图4-13。将每对含磺酰丙氨酸的肽段分别取下,进行氨基酸序列分析,推出二硫桥的位置(肽链内或肽链间)。

现在越来越多的蛋白质氨基酸序列是由核酸的核苷酸顺序推定的,但仍需氨基酸序列分析配合。

§1.8  蛋白质的三维结构  P197  第5章

蛋白质三维结构由氨基酸序列决定,且符合热力学能量最低要求,与溶剂和环境有关。① 主链基团之间形成氢键。② 暴露在溶剂中(水)的疏水基团最少。③ 多肽链与环境水(必须水)形成氢键。

(一)研究蛋白质构象的方法

 (1)X-射线衍射法:是目前最明确揭示蛋白质大多数原子空间位置的方法,为研究蛋白质三维结构最主要的方法。

  步骤为:蛋白质分离、提纯→单晶培养→晶体学初步鉴定→衍生数据收集→结晶解析→结构精修→结构表达。

 (2)其他方法:NMR、紫外差光谱、荧光和荧光偏振、圆二色性、二维结晶三维重构。

(二)稳定蛋白质三维结构的作用力

(1)  弱相互作用(或称非共价键,或次级键)

1. 氢键  2. 疏水作用(熵效应)  3. 范德华力  4. 离子键(盐键)

(2)  共价二硫键

(三)酰胺平面和二面角  P 205  图5-11

(1)  酰胺平面(肽平面):肽键上的四个原子和相连的Cα1和Cα2所在的平面。

(2)  两面角:每个氨基酸有三个键参与多肽主链,一个肽键具有双键性质不易旋转,另两个键一个为Cα1与羰基形成的单键,可自由旋转,角度称为ψ,另一个为NH与Cα2形成的单键也可自由旋转,角度称为φ,ψ和φ称为二面角或构象角,原则上可取-1800~+1800之间任意值(实际受立体化学和热力学因素所限制),肽链构象可用两面角ψ和φ来描述,由ψ和φ值可确定多肽主链构象。

(四)二级结构  P207

  多肽链折叠的规则方式,是能量平衡和熵效应的结果。主链折叠由氢键维持(主要),疏水基团在分子内,亲水基团在分子表面。

  常见的二级结构元件:α-螺旋,β-折叠片,β-转角和无规卷曲。

(1)  α-helix:蛋白质含量最丰富的二级结构。

肽链主链围绕中心轴盘绕成螺旋状紧密卷曲的棒状结构,称为α-螺旋。

1.  两面角 ψ和φ分别在-570和-470附近(φ:从Cα向N看,顺时针旋转为正,逆时针为负;ψ:从Cα向羰基看,顺时针为正,逆时针为负。)

2.  每圈螺旋含约3.6个氨基酸残基,由H键封闭的环中原子数为13,此种α-螺旋又称3.613-螺旋,每周螺距为0.54nm,R基均在螺旋外侧,P208 图5-14。

3.  α-螺旋本身是一个偶极矩,N-末端带部分正电荷,C-末端积累部分负电荷;α-螺旋几乎都是右手螺旋而有手性,并有旋光性,可用圆二色性(CD)光谱研究。

4.  影响α-螺旋形成的因素:R基小且不带电荷,易形成α-螺旋。

如Poly Lys在PH7时,R基带正电荷,静电排斥,不易形成α-螺旋,但若PH=12,消除R基正电荷可形成α-螺旋。

Poly Ile由于R基大,虽不带电也不易形成。 

Pro由于无酰胺H,不能形成链内氢键,所以当Pro和羟脯氨酸存在时,α-螺旋中断,产生一个结节。

(2)  β-折叠片:第二种常见的二级结构

两条或多条相当伸展的多肽链侧向通过氢键形成的折叠片状结构,如P210 图5-17。

肽链主链呈锯齿状,肽链长轴互相平行。

氢键:在不同的肽链间或同一肽链的不同肽段间形成,氢键与肽链长轴接近垂直。

R基:交替分布在片层平面两侧。

有两种类型:平行结构(相邻肽链同向)和反平行结构(相邻肽链反向),见P210图5-18。

(3)  β-转角和β-凸起

  β-转角是球状蛋白的一种简单的二级结构元件。为第一个氨基酸残基的羰基与第四个残基的N-H氢键键合,形成一紧密的环在肽链回折或弯曲时形成,使多肽链出现1800急剧回折,见P211 图5-19。

  β-转角处Gly和Pro出现几率很高。

  β-凸起:是在β-折叠股中额外插入一个残基,凸起股产生小弯曲(P212图5-20),可引起肽链方向稍有改变。

(4)  无规卷曲:泛指那些不能归入明确的二级结构的多肽区段,实际上不是完全无规,而是像其他二级结构那样具有明确而稳定的结构。常构成酶的活性部位和蛋白质的功能部位。

(五)超二级结构

若干相邻的二级结构单元彼此相互作用,形成种类不多、有规则的二级结构组合或二级结构串,在多种蛋白质中充当三级结构的构件,如P221 图5-29所示,有αα,βαβ等。

(六)结构域

  多肽链在二级结构或超二级结构基础上形成的三级结构(局部折叠区),是相对独立的紧密球状实体,称为结构域或域,是球状蛋白质的独立折叠单位。

  对于较小的球状蛋白质分子或亚基,结构域就是三级结构;对于较大的球状蛋白之或亚基,其三级结构往往由两个或多个结构域缔合而成,为多结构域。

  结构域形成再缔合成三级结构动力学更为合理,特定三维排布的结构域形成,有利于结构域之间活性中心的形成,结构域之间的柔性肽链形成的铰链区有利于活性中心与底物结合,以及别构中心结合调节物发生别构效应。

(七)球状蛋白质的三级结构

  球状蛋白质三级结构具有明显的折叠层次:

  二级结构→超二级结构→结构域→三级结构→四级结构(多聚体)。

  分子是紧密球体或椭球状实体,所有原子体积占72~77%,空腔约25%。疏水侧链埋藏在分子内部,亲水侧链暴露在分子表面,球状蛋白是水溶性的。球状蛋白表面上的疏水空穴常用于结合底物、效应物等配体,为行使生物功能的活性部位。

(八)蛋白质折叠和结构预测

(1)  蛋白质变性:天然蛋白质分子受某些物理化学因素,如热、紫外线照射或酸、碱、有机溶剂、变性基的影响生物活性丧失,溶解度降低及物理化学常数改变的过程称为蛋白质变性。

蛋白质变性为分子中次级键破坏,天然构象解体,但变性不涉及共价键(肽键和二硫键)的破裂,一级结构保持完好,只是物化性质和生化性质改变。

变性剂:① 能与多肽主链竞争氢键,破坏二级结构,如尿素、盐酸胍等;② 表面活性剂:破坏蛋白质疏水相互作用,使非极性基团暴露于介质水中,如十二烷基硫酸钠。

变性是一个协调过程,在所加变性剂很窄的浓度范围内,或很窄的pH或温度区间内突然发生。

(2)  氨基酸序列规定蛋白质的三维结构

核糖核酸酶的变性和复性试验:

牛胰核糖核酸酶,为124个氨基酸残基组成单链,包含四个二硫键。

变性:加8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍和巯基乙醇(还原二硫键),酶变性,紧密结构伸展成松散的无规卷曲构象。

复性:将尿素等变性剂和巯基乙醇用透析法除去,酶活性又可恢复,最后达原活性的95~100%。P235 图5-49。

加入极微量巯基乙醇,有助于二硫键重排,加速酶的复性。

复性:变性的蛋白质在一定条件下重建其天然构象恢复其生物活性。

蛋白质天然构聚处于能量最低状态,理论上变性是可逆的,但实际上由于复性所需条件复杂,不易满足而常常遇到困难。

根据分子生物学一个中心原理:顺序规定构象,活性依靠结构,蛋白质结构是可预测的。全新蛋白质设计和蛋白质工程更需要蛋白质结构预测。

(九)亚基缔合和四级结构

(1)  蛋白质四级结构涉及亚基种类和数目,以及亚基在整个分子中空间排布(对称性),亚基的接触位点(结构互补)和作用力(主要是非共价相互作用)。

大多数寡聚蛋白质分子亚基数目为偶数,亚基种类一般是1或2种。

(2)  四级结构缔合的驱动力:弱相互作用(氢键、疏水相互作用,范氏力,盐键),有的亚基聚合还借助亚基之间的二硫桥,如抗体是由两条重键和两条轻链组成的四聚体,二硫键将两条重链与轻链连接在一起,P276 图6-29。

(3)  亚基缔合方式:亚基缔合主要是疏水相互作用,缔合专一性则由表面的极性基团的氢键和离子键提供。

许多蛋白质借异种缔合(相同亚基,但相互作用表面不同)。形成线性或螺旋形的大聚合体,如病毒颗粒外壳,P248 图 5-56显示人免疫缺陷病毒(HIV-I)的核壳由几百个外壳蛋白亚基组成。

(4)  四级结构对称性:是四级结构蛋白主要性质之一,有旋转对称轴,如二聚体,四聚体。

(5)  四级缔合在结构和功能上具有优越性:可增强结构稳定性,提高遗传经济性和效率,使编码所需DNA减少,可使催化基团汇集在一起;具有协同性和别构效应。

别构效应:多亚基蛋白质一般具有多个结合部位,结合在蛋白质分子的特定部位上的配体对该分子和其他部位所产生的影响(如改变亲和力或催化能力)称为别构效应。

具有别构效应的蛋白质为别构蛋白质,酶称为别构酶,具有调节代谢的功能。

1.9  蛋白质结构与功能的关系: P252,第六章

从厌氧生物转化为好氧生物是生物进化中的一大进步。脊椎动物中血红蛋白在血液中起到载氧和输氧的作用,肌红蛋白在肌肉中起贮氧和氧在肌肉中分配的作用。

(一)肌红蛋白(Mb)的结构与功能

(1)  三维结构:由一条多肽链和一个血红素辅基构成,相对分子量16700,含153个氨基酸残基。分子中多肽链由8段α-螺旋组成,分子结构致密结实,带亲水基团侧链的氨基酸分布在分子外表面,疏水氨基酸侧链几乎全埋在分子内部,见P253 图6-1。

(2)  辅基血红素:由二价铁和原卟啉Ⅸ组成,原卟啉Ⅸ由4个吡咯环组成,见P254 图6-2。

铁原子只有亚铁态的蛋白质才能结合氧。蛋白质提供疏水洞穴,固定血红素基,保护血红素铁免遭氧化,为氧提供一个结合部位。结合氧只发生暂时电子重排。

(二)血红蛋白(Hb)的结构与功能

(1)  血红蛋白由4个多肽链(亚基)组成,如α2β2(成人血红蛋白HbA),每个亚基都有一个血红素基和一个氧结合部位,α-链有141个残基,β-链有146个残基,且α链、β链和Mb的三级结构都非常相似(P259 图6-9)。实际上对于人的这三种多肽链分析发现只有27个的残基是共有的,这表明蛋白质高级结构的保守性。只要功能相同(都与氧结合),高级结构就相似,有时甚至是唯一的。

血红蛋白与肌红蛋白结构上最大不同在于血红蛋白有四级结构,是四聚体,,而肌红蛋白只有三级结构。因此血红蛋白运载氧能力增强,还能运载H+和CO2,在氧分压变化不大范围内完成载氧和卸氧工作。且Hb为变构蛋白,可受环境中其他分子,如H+,CO2和2,3-二磷酸甘油酸(BPG)的调节。

(2)  氧结合引起血红蛋白构象变化,氧合血红蛋白和去氧血红蛋白在四级结构上有显著不同,发生构象变化。

氧与血红蛋白结合是协同进行的,具有正协同性同促效应,即一个氧分子与Hb结合,使同一Hb分子中其余空的氧结合部位对氧亲和力增加,再结合第二、三、四个氧分子则比较容易。

(3)  Hb和Mb氧合曲线如P262 图6-14所示。

P(O­2):氧分压,表示氧的浓度(氧浓度与氧分压成正比)。

Y:氧饱和百分数,为被占氧合部位与氧合部位总数之比。

当Y=0,所有氧合部位空着;Y=1,所有氧合部位被氧占据;Y=0.5,半载,此时所需氧分压大小为对氧亲和力指标。

Mb氧合曲线为双曲线;Hb氧合曲线为S型曲线。

S曲线分析:

① 肺区氧分压较高,P(O2)约为100torr(空气中氧分压760×21%=160torr),Y=0.97,近于1,载氧。

② 组织肌肉中需氧,P(O2)约为20torr,Y=0.25,卸氧。

③ ΔY:氧饱和百分数变化;ΔP(O2):氧分压变化。

肺区和组织肌肉中氧分压变化:ΔP(O2)=100―20=80torr,Hb氧饱和百分数变化为,ΔY=0.97―0.25=0.72,表示有近3/4氧可从Hb上卸下。由此可知在S曲线上,即使P(O2­)变化不大(仅80torr),也有较多的氧卸下,输氧效率较高,可完成输氧,ΔP(O2)在20~100torr范围变化,为Hb工作区;相比Mb的双曲线,ΔP(O2)在20~100torr范围变化,ΔY只有0.1,表示氧不易卸下,只能担负贮氧功能。

Hb与Mb功能差别只是因为Hb有四个亚基,有四级结构,可进行协同载氧和卸氧工作,Mb只能贮氧。

(4)  H+,CO2和BPG(2,3-二磷酸甘油酸)对血红蛋白结合氧的影响 : 

它们与Hb结合部位离血红素基甚远,是通过别构效应调节Hb与氧的结合。

1.  波尔效应(Bohr):

pH降低(H+增加),CO2压力增加均降低血红蛋白对氧亲和力,促进血红蛋白释放氧;反之高浓度氧又促使脱氧血红蛋白释放H+和CO2。

P264 图6-17:pH减少使S曲线右移,而H+增加、CO2增加均使pH减少。

生理意义:在组织区CO2产生,为高CO2区,pH约7.2,有利于Hb释放氧,载CO2;在肺区氧吸入,pH约7.6,有利于Hb与氧结合,放出CO2。

2.  BPG降低Hb对氧亲和力:

BPG可由糖代谢产生,正常人血液中约含4.5mmol/L,约与血红蛋白等摩尔数。

P265 图6-19显示出在不同BPG浓度下血红蛋白的氧合曲线,BPG浓度增加,Hb氧合曲线右移。

① 无BPG, Hb氧合曲线为双曲线,不易卸氧;

② 当BPG=4.5mmol/L时(正常生理状况),为S型曲线,可卸氧,此时P(O2)=26torr,Y=0.5;

③ 当BPG=7.5mmol/L时(非正常生理状况如高山反应,及病理状况如肺气肿),S曲线右移,更易卸氧,满足肌体对氧需求,此时P(O2)为34torr,Y=0.5。

(三)血红蛋白分子病

人类已发现300多种不同突变的血红蛋白,许多突变是有害的,产生遗传病,如镰刀状细胞贫血症:

病状:贫血症;

检查:血液中含大量镰刀形红细胞HbS,没有足够可承担输氧的正常圆形细胞HbA。镰刀状细胞贫血病是血红蛋白分子突变引起的。

研究:电泳发现HbS和HbA电泳速度和等电点均有差异。在pH8.6下均向正极移动,但HbS比HbA稍慢,说明HbS比HbA少几个带负电荷基团。

氨基酸测序发现HbA与HbS区别在于β-链上6-位Glu(HbA)变为Val(HbS),结果由于疏水相互作用,β-链上6-Val与1-Val接近,使血红蛋白分子从扁平状压缩变形,形成细长聚集体红细胞,构成镰刀形,与氧结合力降低。

值得注意的是血红蛋白分子四条肽链共574个氨基酸残基,只两个β-链上的氨基酸被代替(2Glu→2Val),即引起如此严重疾病。

1.10  蛋白质分离和纯化  P290  7章

(一)蛋白质分子量测定:

(1)  根据化学组成测最低分子量:

1.  肌红蛋白、血红蛋白均含铁0.335%,分别求它们的最低分子量:

肌红蛋白为55.8(Fe原子量)÷0.335×100=16700,与其他方法测分子量相符。

血红蛋白含铁也是0.335%,最低分子量也为16700,但用其他方法测分子量为68000,即每一个血红蛋白含有4个铁原子,由此计算更为准确分子量为:16700×4=66800。

2.  由氨基酸含量计算:

如牛血清清蛋白含Trp0.58%,蛋白质最低分子量为35200;每一牛血清蛋白含有2个Trp,所以分子量为70400,比其他方法测出的准(69000)。

(2)  沉降系数和沉降系数单位:

蛋白质分子在溶液中受强大离心力作用时,蛋白质分子沉降,沉降速度与蛋白质分子大小和密度、分子形状等有关,可用于测分子量。

沉降系数:蛋白质颗粒在单位离心场的沉降速度是个定值,称为沉降系数或沉降常数用s表示。

s常用来近似描述生物大分子的大小,蛋白质、核酸、核糖体和病毒的沉降系数介于1×10-13到200×10-13sec范围,见293 表7-4。

为方便起见,把10-13sec作为一个单位,称为svedberg(斯维得贝格)单位或沉降系数单位,用S表示,如人的Hb沉降系数为4.46S,即为4.46×10-13sec。

(二)蛋白质胶体性质与蛋白质的沉淀:

蛋白质溶液属胶体系统,分散相质点大小1~100nm。

蛋白质可用盐析,有机溶剂沉淀,生成重金属盐、加生物碱和某些酸类(如三氯乙酸)进行沉淀;蛋白质加热变性也会沉淀。

(三)蛋白质的分离纯化:

(1)  前处理:将蛋白质从动、植物或细菌的组织或细胞中以溶解状态释放出来,并保持天然状态,不丢失生物活性,如用适当缓冲液提取蛋白质,离心除去杂质。

(2)  粗分离:将蛋白质提取液中所需要的蛋白分出,除去其他杂蛋白、核酸和多糖等。

1.  等电点沉淀和pH控制:

等电点沉淀:改变蛋白质溶液pH,使蛋白质净电荷为零处于等电点,相邻蛋白分子间无静电斥力,溶解度最低,蛋白保持天然构象聚集沉淀。

P305 图7-10 pH和离子强度对β-乳球蛋白溶解度的影响,等电点为pH5.2~5.3,溶解度最低。

由于不同蛋白有不同等电点,也可将一些蛋白质混合物分开。

2.  盐溶和盐析:

盐析:当溶液中盐浓度增大,离子强度达一定数值时,蛋白质溶解度下降并进一步析出。

盐析蛋白保持天然构象,能再溶解。一般用硫酸铵盐析,硫酸铵在水中溶解度高,且溶解度的温度系数较低。

盐溶:当加入低浓度中性盐时,蛋白质溶解度增加。

(3)  细分级分离:

一般用层析法和电泳法。

1.  电泳:在外电场作用下,不处于等电状态的带电颗粒(如蛋白质分子)

将向着与其电性相反的电极移动的现象称为电泳。

  电泳迁移率或泳动度(μ):为单位电场强度下,蛋白质分子在溶液中的移动速度。

  μ = υ/E  υ:颗粒泳动速度,E:电场强度

常用的电泳种类:

①  区带电泳:在支持物上电泳时,蛋白质混合物被分离成若干区带。

②  薄膜电泳:使用醋酸纤维薄膜和聚酰胺薄膜。

③  凝胶电泳:凝胶有分子筛效应,可更好分离。如常用的聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)。

④  毛细管电泳(HPCE):毛细管散热好,有助于消除热引起的对流和区带变宽;系统高分辨力,进样量少,可分离手性化合物。

⑤  等电聚焦电泳:具有不同等电点的两性电解质载体在电场中自动形成pH梯度,使被分离物移动至各自等电点的pH处,聚集成很窄的区带。

分辨率高,适于分离分子量相同而电荷不同的两性分子。

pH梯度制作:可利用两性电解质,已有商品出售。

2.  亲和层析:是利用对配体的特异生物学亲和力的纯化方法,可一步提纯。

根据生物分子与特定固相化配体(Ligand)之间的亲和力不同,而使生物分子在一种特制的具有专一吸附能力的吸附剂上进行层析。

例如将酶的底物或抑制剂接到固体支持物上(如琼脂糖),制成专一吸附剂,并装在层析柱中。当含有这种酶的溶液通过层析柱时,酶就会被吸附,而其他蛋白质则不被吸附先流出;然后再用适当缓冲液将吸附在柱上的酶洗脱下来。

(4)  结晶:

结晶为蛋白质纯度一个标志,也是判断制品处于天然状态指标。蛋白质纯,则易结晶,为分离提纯最后步骤。

  第二章  酶与辅酶  P319 

酶是研究生命科学的基础,生命体系中几乎所有化学反应都是在酶催化下进行的。酶又是生命化学和化学的重要结合点。

酶化学内容:

  1. 酶作用机制,酶的抑制剂和激活剂,并由此设计和制造医药、农药。

2. 人工模拟酶:用小分子(有机)化合物模拟酶的活性部位,模拟酶的作用方式。

  3. 以酶为工具进行化学反应,如不对称合成。

  4. 利用免疫系统制备有预定活性的催化抗体即抗体酶。

  5. 化学酶工程:将酶学与化学工程技术相结合,在工业上使用酶和固定化酶。

§2. 1  酶催化作用特点:

(一)酶是催化剂:降低酶促反应活化能。

(二)酶是生物催化剂:

(1)  反应条件温和,常温常压,中性PH,酶易失活。

(2)  酶具有很高催化效率,比非催化反应一般可提高108~1020倍。

(3)  酶具有高度专一性:

反应专一性:催化一种或一类反应。

底物专一性:只作用一种或一类物质。

(4)  酶活性受调节控制:

1.  调节酶的浓度:

诱导或抑制酶的合成,如消化乳糖的三种酶的产生受乳糖操纵子控制。

2.  激素调节:

激素通过与细胞膜或细胞内的受体相结合而调节酶的活性。

如乳糖合成酶是由两个亚基组成,一个催化亚基,一个调节亚基,催化半乳糖和葡萄糖生成乳糖。平时催化亚基单独存在,只催化半乳糖与蛋白质反应合成糖蛋白;但当动物分娩后,激素急剧增加,调节亚基大量产生,与催化亚基一起构成二聚体的乳糖合成酶,改变催化亚基专一性,催化半乳糖和葡萄糖反应生成乳糖。

3.  反馈抑制调节:

许多物质合成是由一连串反应组成的,催化此物质生成的第一步的酶可为它们的终端产物所抑制。 P323 图8-2。

如由Thr合成Ile经过5步,当终产物Ile浓度达足够水平,催化第1步反应的苏氨酸脱氨酶被抑制;当Ile浓度下降后,酶的抑制解除。

4.  抑制剂、激活剂调节:

酶的抑制剂、激活剂的研究是药物研究的基础。磺胺药可抑制四氢叶酸合成所需酶,进而抑制核酸和蛋白质的合成,故可杀菌。

5.  酶原的激活:

凝血酶、消化酶等酶先以一个无活性的前体形式(酶原)被合成,然后在一个生理上合适的时间和地点被活化成酶,才具有催化活性。

6.  共价修饰:

酶被共价修饰后,活性被调节,如在激酶催化下酶被磷酸化而表现出催化活性;磷酸基团水解,活性又可逆转。

7.  别构调控:

别构酶通过效应物来对酶活性进行调控。

§2. 2  酶的化学本质及其组成:

(一)酶是蛋白质:

水解最终产物为氨基酸,并具有蛋白质各种性质。

(二)酶的分类:

由化学组成不同分为单纯蛋白质和缀合蛋白质。缀合蛋白质除蛋白质外还要结合一些非蛋白质小分子或金属离子才表现出酶的活性,由蛋白质部分(称为脱辅酶或酶蛋白)和非蛋白部分(称为辅因子或辅助因子)两部分组成,两者结合的复合物称为全酶。

全酶 = 脱辅酶 + 辅因子

  P324 表8-4 列出可作辅因子的金属离子,P325 表8-5 列出辅酶和辅基(总称辅助因子)。

  辅酶:与脱辅酶结合比较松弛的小分子有机物,经透析可除去。

  辅基:与共价键和脱辅酶结合,透析法不可除去。

  辅酶和辅基无严格界限。

(三)单体酶、寡聚酶和多酶复合物:

(1)  单体酶:一般由一条肽链或多肽链组成的酶,多为水解酶。如溶菌酶(一条肽链),胰凝乳蛋白酶(三条肽链)。

(2)  寡聚酶:由两个或两个以上的亚基组成的酶,许多为调控酶。P325表8-6,P326表8-7。

(3)  多酶复合体:由几种酶靠非共价键彼此嵌合而成,所有反应依次连接。催化一系列反应连续进行,如糖代谢中丙酮酸脱氢酶复合体,由60个亚基、三种酶组成。

§2.3  酶的命名和分类:

(一)习惯命名法:

(1)  根据酶作用的底物命名:

如 淀粉酶:催化水解淀粉;  蛋白酶:水解蛋白。

有时加上酶的如胃蛋白酶,胰蛋白酶。

(2)  根据酶催化反应的性质及类型命名:

如 水解酶、转移酶和氧化酶。

(3)  有时由上述两原则结合起来命名:

如 琥珀酸脱氢酶。

习惯命名简单,但缺乏系统性,不严格,现仍在使用。

(二)国际系统命名法:

以酶所催化的整体反应为基础,并明确表明酶的底物及催化反应性质。P327表8-8。

如 乙醇:NAD+氧化还原酶。

  底物:乙醇、NAD+,中间用冒号隔开。

  催化反应:氧化还原,乙醇 + NAD+  乙醛 +  NADH。

若底物之一是水,可将水略去不写,如脂肪:水解酶。

(三)国际系统分类法及酶的编号:

由酶所催化反应的类型将酶分为六大类。

由底物中被作用的基团或键的特点,将每一大类又分为若干亚类,每一亚类又分为亚亚类,第四个数字为排号。由此每个酶的编号由四位数字组成,编号前冠以EC,数字用“.”隔开,如谷丙转氨酶编号为:EC 2.6.1.2.。

P327 表8-9 酶的分类,指明了酶的编号,系统名称、习惯名称及所催化的反应。

(四)六大类酶介绍:

(1)  氧化还原酶 (Oxido-reductases):

1.氧化酶:催化底物脱氢并氧化生成H2O2或H2O。

2.脱氢酶:直接从底物上脱氢。

3.氧合酶:如催化甲烷氧合生成甲醇。

4.过氧化物酶:如超氧化歧化酶SOD。

(2)  转移酶(Transferases):

将一种分子的某一基团转移到另一种分子上。

通式:A.X + B  A + B.X

如转氨酶,转酮醛基酶,转糖苷基酶等。

(3)  水解酶(Hydrolases):

通式:AB + HOH  AOH + BH

催化水解酯键,如脂肪酶、核酸酶;水解糖苷键,如淀粉酶、溶菌酶;水解肽键,如蛋白酶。

(4)  裂合酶(Lyases):

催化从底物移去一个基团而形成双键的反应或其逆反应。

通式:A.B  A + B

如脱羧酶,断C-C键,生成CO2;碳酸酐酶,断C-O键,生成CO2。

(5)  异构酶(Isomerases):

催化各种同分异构体之间相互转变,使分子发生重排。

通式:A  B

如消旋酶,差向异构酶、顺反异构酶等。

(6)  连接酶(Ligases):

催化有ATP参加的合成反应,能量由ATP供给。

通式:A + B + ATP  AB + ADP(AMP)+ Pi(PPi)

在科学文献中,应先给出酶的系统名称和编号,下面文中为方便仍可用习惯命名。

§2.4  酶的专一性:

(一)结构专一性:对底物要求严格。

1.  绝对专一性:只作用一种底物,如脲酶水解尿素。

2.  相对专一性:作用于一类结构相近的底物。

①  族专一性或基团专一性:对作用键的两端基团,一端要求严格,对另一端要求不严格。如 α-D-葡萄糖苷酶,要求糖苷键一端为葡萄糖,另一端可为果糖(如蔗糖),或葡萄糖(如麦芽糖)。

②  键专一性:只作用一定的键,对键两端基团无严格要求。如脂酶,蛋白酶。

(二)立体异构专一性:

(1)  旋光异构专一性:如只作用L-氨基酸,可用于氨基酸的拆分。

(2)  几何异构专一性:如琥珀酸脱氢酶只生成反丁烯二酸。

(3)  潜手性识别:对潜手性分子上的原子有识别性,如酵母醇脱氢酶,只作用尼克酰胺环的C4上的HA。

(三)酶作用专一性假说:

(1)  锁与钥匙学说:

酶与底物为锁与钥匙的关系,见P334 图8-5。但“刚性模板”无法解释反应物和底物均为酶的底物。

(2)  诱导契合假说:

酶与底物分子接近时,酶蛋白受底物分子诱导其构象发生有利于与底物结合的变化,酶与底物在此基础上互补契合,并进行反应,如P335 图8-6所示。

酶与底物结合时有显著构象变化,已为X-衍射所证实。酶构象改变,底物构象也发生变化,形成过渡态,由此引出过渡态学说。底物和酶先结合成中间复合物,底物被活化成过渡态。在酶促反应中,已获得大量底物过渡态,并由此推导出许多过渡态类似物作为设计农药、医药、抗体酶的依据。

1.  农药:如乙酰胆碱酯酶水解神经传导递质—乙酰胆碱的酯键,乙酰胆碱水解时的过渡态为四面体,其过渡态类似物为磷酸酯,由此设计能抑制乙酰胆碱酯酶的化合物,即可成为有机磷农药和有机磷毒气。

2.  医药:过渡态类似物已成为当前设计新杀菌剂和药物的重要依据,过度态类似物往往是酶的抑制剂。

3.  抗体酶:利用哺乳动物的免疫体系的选择性和多变性,经过特定的抗原结构的设计和诱导,制备具有预定催化活性的蛋白分子,即抗体酶,又称催化抗体。

由反应机制确定底物反应过渡态,由反应过渡态设计过渡态类似物。以过渡态类似物为抗原,诱导哺乳动物的免疫系统产生抗体,经大量筛选后找出具有催化反应活性的抗体分子,经单克隆抗体制备抗体酶。目前已有能催化20多种、40多个化学反应的抗体酶被制备,包括酶促反应六大类型,还可催化生物体内酶所不能催化反应,如Diels-Alder反应。

§2.5  酶的活力测定:

在分离纯化酶的过程中,在酶存放后及使用前都需测酶活力。通过酶活力测定进行酶促反应动力学研究,进行酶抑制剂、激活剂(医药、农药)的研究。

(一)  酶活力:指酶催化某一化学反应的能力,酶活力大小可用在一定条件下所催化的某一化学反应的反应速率来表示。

研究酶反应速度应以反应初速度为准,因为随时间延长、底物浓度下降和酶部分失活等,酶促反应速度下降。一般在底物变化量5%以内,反应速度保持不变,为反应初速度。

(二)酶的活力单位:

酶单位(U):在一定条件下,一定时间内将一定量的底物转化为产物所需的酶量。

酶国际单位(IU):在最适反应条件(温度250C,最适PH,最适底物浓度)下,每分钟催化1μmol底物转化为产物所需的酶量定为一个酶活力单位(1961年订立),1IU = 1μmol/min。

酶活力国际单位,即Katal(简称Kat)单位。在最适条件下,每秒钟能催化1mol底物转化为产物所需的酶量,定为1Kat单位。

1 Kat = 1 mol.s-1 = 60 × 106 IU  (1972年定)。

  酶活力习惯沿用单位:每小时催化1g或1mL底物所需要的酶量。表示不够严格,但方便。

(三)酶的比活力:

每mg酶蛋白所具有的酶活力单位数。对同一种酶,比活力越大,酶的纯度越高,一般用U/mg蛋白表示;对酶制剂为U/g酶制剂或U/mL酶制剂(表示酶含量)。

比活力大小表示单位蛋白质的催化能力。

(四)酶活力测定方法:

1.  分光光度法:底物和产物在紫外或可见光部分光吸收不同。

2.  荧光法:灵敏度高。

3.  同位素法:灵敏度极高,用3H、14C、32P、131I等标记化合物。

§2.6  酶工程简介:  P344

研究酶制剂在工业大规模生产及应用,分为化学酶工程和生物酶工程。

(一)天然酶已被广泛应用:

加酶洗衣粉(蛋白酶),食品饮料防腐(溶菌酶),纺织布褪浆(淀粉酶),皮革软化脱毛(蛋白酶),澄清果汁(果胶酶)等;医疗上用L-门冬酰胺酶抗肿瘤,脲酶治尿毒症等。

(二)化学修饰酶:

对酶分子进行化学修饰,改善酶的性能。如抗白血病药物L-门冬酰胺酶游离氨基用HNO2脱氨基或酰化,可使酶稳定性有很大提高;用葡聚糖修饰超氧化歧化酶SOD,可使其半衰期几十倍增长,抗原性消失,耐热性提高。

(三)固定化酶:

将水溶性酶用物理或化学方法处理,使之成为不溶于水,但仍具有酶活性的制剂称为固定化酶。

(1)  吸附法:将酶蛋白吸附在不溶性载体上,如活性炭,硅胶,分子筛,微孔玻璃,纤维素和离子交换树脂上。

如用葡萄糖淀粉酶和葡萄糖异构酶制备的固定化酶已大规模用于从淀粉经葡萄糖制备果糖,用于替代蔗糖。

(2)  共价偶联法:将酶蛋白上的非必需侧链基团与载体上的基团通过化学反应形成共价键结合。载体可用天然和合成高分子聚合物,将载体官能团活化连接上间隔臂后,再在温和条件下与酶偶联,间隔臂使酶分子与载体骨架有一定距离,使底物与酶易接近。

(3)  交联法:用双功能试剂,如戊二醛等将酶分子交联成网状结构,成为不溶性酶。

常与吸附法或包埋法结合使用。

(4)  包埋法:将酶包裹在凝胶的细微格子中或被半透性聚合膜所包围。小分子底物和产物可自由通过,而酶固定其中。

包埋法还可包埋固定化细胞、细胞器、菌体等。

(四)人工模拟酶:

根据酶的结构、功能以及催化机制,用化学合成法合成具有酶催化活性的人工酶制剂。如环糊精模拟酶,见P347 图8-17。

有的模拟酶作用方式,有的模拟酶的活性中心。

2.16  辅酶  P440  11章

维生素B族为水溶性维生素,有B1、B2、PP、B6、泛酸、生物素、叶酸及B12,在生物体内通过构成辅酶而发挥作用。

(一)Vit B1(硫胺素)和TTP(硫胺素焦磷酸):

结构式见P441 图11-6,活性部位为噻唑环2-位,C2上的H易离开(为3-位N+稳定)。

催化反应: (见P441)

1.  脱羧反应:为丙酮酸脱羧酶辅酶(α-裂解反应)。

2.  乙偶姻、苯偶姻缩合反应:乙酰乳酸合成酶辅酶(α-缩合反应)。

3.  α-酮转移反应:转酮酶辅酶。

Vit B1在糖代谢中重要。

(二)维生素PP和酰胺辅酶:

维生素PP包括烟酸和烟酰胺(尼克酰胺),结构式见P444,与核糖、磷酸、腺嘌呤构成烟酰胺辅酶,活性部位为吡啶环的C-4位,能接受和给出氢离子。

烟酰胺辅酶结构式见P444 图11-11,包括:

(1) NAD+(氧化型)和NADPH(还原型):辅酶Ⅰ,烟酰胺腺嘌呤二核苷酸。

(2) NADP+(氧化型)和NADPH(还原型):辅酶Ⅱ,烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸。

它们为各种脱氢酶(至少六种脱氢酶)的辅酶,催化的反应见P445 图11-13。在细胞呼吸、糖酵解及脂肪合成中重要。

(三)维生素B2和黄素辅酶:

Vit B2又名核黄素,在体内以黄素单核苷酸(FMN)和黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)形式存在,是体内一些氧化还原酶(黄素蛋白)的辅基。

结构式见P445 图11-14。活性部位为异咯嗪环的1,5位。FAD和FMN的氧化还原态见P446 图11-15。

催化多种氧化还原反应,如P446 表11-2所示。

黄素是比NAD+和NADP+更强的氧化剂,能促进糖、脂肪和蛋白质的代谢。

(四)泛酸(遍多酸)和辅酶A(CoA):

辅酶A分子由β-巯基乙胺、泛酸(β-丙氨酸和泛解酸)及3',5'-ADP所组成,结构式见P447图11-16。活性部位为巯基乙胺的-SH,所以辅酶A又写成HSCoA,主要起传递酰基作用,为酰化反应中的辅酶。若携带乙酰基则为乙酰辅酶A,在糖代谢、脂代谢、氨基酸代谢中为重要的辅酶。

(五)维生素B6和磷酸吡咯醛、磷酸吡咯胺:

Vit B6包括三种物质:吡咯醛、吡咯胺和吡咯醇(在体内可互相转化),结构式见P449,活性部位为醛基(吡咯醛)或氨基(吡咯胺)。它们的磷酸酯-磷酸吡咯醛(PLP)和磷酸吡咯胺是氨基酸代谢中多种酶的辅酶,能催化转氨、脱羧、羟醛缩合反应等至少七种不同的反应,如P450 图11-22所示。反应一般均经Schiff碱(醛亚胺、酮亚胺)的形式进行。

(六)维生素B12(氰钴胺素)及其辅酶:

结构式见P452 图11-24。

Vit B12为参与DNA合成酶的辅酶,参与甲基转移、分子重排等三种类型反应,见P452图11-25。

(七)生物素(Vit H):

生物素是由噻吩环和尿素结合而成的双环化合物,左侧链上由一分子戊酸,结构式见P454。活性部位在环上1',3'-氮原子处,可接受CO2,在酶促羧化反应中作为活动羧基载体。

生物素(Biotin)与亲合素(Avidin,抗生物素蛋白)特异性结合,已发展成重要免疫化学技术,用于检测、分离提纯及制备新型生物传感器。

(八)酸和四氢叶酸(Vit M,Vit B11)

叶酸(Folic acid),又称蝶酰谷氨酸,由2-氨基-4-羧基-6-甲基喋啶、对氨基苯甲酸和L-Glu三部分组成,结构式见P456。由喋啶环被还原程度不同,又分为叶酸(FA),二氢叶酸(DHF)和四氢叶酸(THF)。其中THF是叶酸的活性辅酶形式,称为辅酶F,为一碳单位的重要供体和受体。THF活性部位为喋啶环中的N5和对氨基苯甲酸的N10,THF可携带转移的一碳单位如P457 表11-5所示,有甲基、甲酰基、亚胺甲基和次甲基等。

THF在核苷酸合成中为一碳单位引入所必需的辅酶,为许多抗癌、抗菌药物研究的出发点,如抗癌药物氨甲喋呤为二氢叶酸还原酶的抑制剂。

(九)硫辛酸:

结构式见P459 图11-34,在体内以闭环二硫化物形式(氧化型:1,2-硫戊环-3-戊酸)和开链还原型(二氢硫辛酸,环打开有两个巯基)两种结构混合物存在,并通过氧化-还原循环相互转换。硫辛酸作为辅酶在α-酮酸氧化作用和脱羧作用时行使偶联酰基转移和电子转移的功能,为酰基的载体,可传递电子和酰基。

§2.8  酶促反应动力学  (P351)

(一)底物浓度对酶反应速率的影响

用反应初速度v对底物浓度[S]作图得P355 图9-6。

曲线分以下几段:

(1)  OA段:反应底物浓度较低时v与[S]成正比,表现为一级反应, v = k[S]。

根据酶底物中间络合物学说,酶催化反应时,首先和底物结合生成中间复合物ES,然后再生成产物P,并释放出E。

E + S = ES → P + E

  OA段上,底物浓度小,酶未被底物饱和,有剩余酶,反应速率取决于ES浓度,与[S]呈线性关系,v正比于[S]。

(2)  AB段:反应速度不再按正比升高,表现为混合级反应。此时酶渐渐为底物饱和,[ES]慢慢增加,v也慢慢增加,为分数级反应。

(3)  BC段:反应速度趋于Vmax,为零级反应,酶促反应表现出饱和现象。此时底物过量[S] [E], [E]已转为[ES]而恒定,因此反应速率也恒定,为最大反应速率,Vmax为[E]所决定。

非催化反应无此饱和现象。

酶与底物形成中间复合物已得到实验证实。

(二)酶促反应力学方程式

(1)  米氏方程推导

1913年Michaelis和Menten提出并推导出表示[S]与v之间定量关系的米氏方程

Vmax[S]

  V =

Km + [S]

  Km:米氏常数,物理意义为反应速率为最大速率Vmax一半时底物的浓度,单位与底物浓度同。

  推导:酶促反应分两步进行。

  k1  k3

  E + S   ES → P + E

  k2

v = k3 [ES]

  一般k3­为限速步骤 v = k3 [ES]  … ①

1.  [ES] 生成速率:

  d[ES]/dt = k1([E] - [ES]) [S]

2.  [ES]分解速率:

-d[ES] / dt = k2 [ES] + k3 [ES] = (k2 + k3) [ES]

3.  稳态下[ES]不变,ES生成速率和分解速率相等:

k1 ([E]- [ES]) [S] = (k2+k3) [ES]

4.  引入Km: 令Km = k2+k3 / k1

代入Km = ([E]- [ES]) [S] / [ES] ,

  Km [ES] = [E] [S]- [S] [ES],  [ES] (Km + S) = [E] [S],

[ES] = [E] [S] / Km+[S],

5.  代入①式:v = k3 [ES] = k3 [E] [S] / Km + [S]  … ②

6.  引入Vmax:为所有酶都被底物饱和时的反应速率,即此时[E]= [ES]

Vmax = k3 [ES] = k3 [E]

代入②式:v = Vmax [S] / Km + [S]

米氏方程表示Km及Vmax已知时,v~[S]的定量关系。

(2)  米氏常数的意义

1.  Km是酶的一个特性常数,Km大小只与酶性质有关,而与酶浓度无关。当底物确定,反应温度,pH及离子强度一定时,Km值为常数,可用来鉴别酶。P359 表9-1 列出一些酶的Km值。一般Km在1×10-6~10-1mol/L之间。

不同的酶Km值不同,测定Km要在相同测定条件(pH、温度、离子强度)下进行。

2.  Km值可用于判断酶的专一性和天然产物,若一个酶有几种底物就有几个Km值,其中Km值最小的底物称为该酶的最适底物,又称天然底物。

3.  1 / Km可近似表示酶与底物亲和力的大小。

真正表示酶与底物亲和力为Ks=k2 / k1 ,(注 Km= k2+k3 / k1)。

4.  已知Km可由[S]计算v,或由v计算[S]。

5.  Km可帮助推断某一代谢反应的方向和途径。

Km小的为主要催化方向(正、逆两方向反应Km不同)。

(3)  Vmax和k3(kcat)的意义:

酶浓度[E]一定,则对特定底物Vmax为一常数。催化常数 kcat 又称酶的转化数,数值上与k3同,为酶被底物饱和时,每秒钟每个酶分子转换底物的分子数。

大多数酶的kcat 为1~104/sec,见P322 表8-2,为每秒钟酶促反应每微摩尔酶分子转换底物的微摩尔数。kcat越大,酶催化效率越高。

(4)  kcat / Km的意义:

生理条件下S Km,  Vmax = kcat [E]

代入米氏方程 v = kcat [E] [S] / Km + [S] = kcat [E] [S] / Km

得出:v = kcat / Km[E][S]

kcat / Km为[E]和[S]反应形成产物的表观二级速度常数,单位:L/mol s。可以比较不同酶或同一种酶催化不同底物的催化效率,见P362 表9-4。 

kcat / Km大小可以比较不同酶或同一种酶催化不同底物的催化效率。

(三)米氏常数求法:

(1)  双倒数法:

1 / v = Km  / Vmax×1 /[S] + 1 / Vmax

以1 / v ~ 1 / [S]作图,见P363 图9-10

纵轴截距:1 / Vmax;横轴截距:-1 / Km;斜率:Km / Vmax。

(2)v ~ v / [S]法 (Eadic-Hofstee):

  v = -Km×v / [S] +Vmax  以v ~ v / [S]作图,见P363 图9-11。

  斜率:-Km;纵轴截距:Vmax;横轴截距:Vmax / Km。

(3)[S] / v ~ [S]法 (Hanes-Woolf):

  [S] / v = Km / Vmax + 1 / Vmax×[S] 

 以[S] / v ~ [S]作图,见P363 图9-12

  斜率:1 / Vmax;纵轴截距:Km / Vmax;横轴截距:-Km。

§2.9  酶的抑制作用

失活作用:使酶蛋白变性而引起酶活力丧失。

抑制作用:酶的必需基团的化学性质改变而引起酶活力降低或丧失,但不引起酶蛋白变性。

引起抑制作用的物质称为抑制剂。研究酶的抑制剂,可以研究酶的结构与功能、酶催化机制,进行药物、农药的设计与筛选。

(一)抑制作用的类型:

(1)  不可逆抑制作用:

  抑制剂与酶必需基团以共价键结合而引起酶活力丧失,不能用透析、超过滤等物理方法除去抑制剂而使酶复活,酶被化学修饰。

(2)  可逆抑制作用:

抑制剂与酶以非共价键结合而使酶活力降低或丧失,能用物理方法除去抑制剂而使酶复活。

可逆抑制又分为三种类型,如P369 图9-17所示。

1. 竞争性抑制:抑制剂(I)和底物(S)竞争酶的结合部位,从而影响了底物与酶的正常结合。

抑制剂结构大多与底物类似,许多底物过渡态类似物为抑制剂。抑制剂与酶活性部位结合形成EI复合物,抑制酶与底物的结合。竞争性抑制可以通过增加底物浓度而解除,如丙二酸或戊二酸对琥珀酸脱氢酶的抑制。

2. 非竞争性抑制:底物和抑制剂同时和酶结合,两者无竞争作用。I与S结构无共同之处,酶活性降低或被抑制,不能用增加底物浓度来解除抑制,如Leu是精氨酸酶非竞争性抑制剂。

3.  反竞争性抑制:酶只有与底物结合后才能与抑制剂结合。常见于多底物反应中,如肼类化合物抑制胃蛋白酶。

(二)可逆抑制作用和不可逆抑制作用动力学鉴别

加入一定量抑制剂,以v与酶浓度[E]作图,见P370 图9-8。

加不可逆抑制剂使直线原点右移,斜率不变,加入酶使浓度大于不可逆抑制剂,才表现酶活力;加可逆抑制剂,直线原点不动,斜率变小。

(三)可逆抑制作用动力学

(1)  竞争性抑制:1 /v ~ 1 /[S]作图见P371 图9-20,Vmax不变,Km变大。

纵轴截距:1 /Vmax不变,Vmax不变,底物浓度足够高,可克服抑制作用;横轴截距:1 /Km变小,Km变大;斜率:Km / Vmax变大。

(2)  非竞争性抑制:1 /v ~ 1 /[S]作图见P372 图9-21,Vmax变小,Km不变。

纵轴截距:1 /Vmax变大,Vmax变小;横轴截距:-1 /Km不变,Km不变;斜率:Km / Vmax变大。

(3)  反竞争性抑制:1 /v ~ 1 /[S]作图见P373 图9-22,Km,Vmax都变小。

(四)一些重要的抑制剂:

(1)  不可逆抑制剂:

1.  有机磷化合物:与脂酶活性部位Ser–OH共价结合,如抑制胆碱酯酶,使乙酰胆碱不能分解而积累,使一些以乙酰胆碱为传导介质的神经系统处于过于兴奋状态,引起神经中毒。

如神经毒剂和有机磷农药,结构式见P374。

可用能与磷酸根有更强结合力的化合物将酶游离出,从而解毒,如用肟类化合物解磷定,结构式见P374。

2.  有机砷化合物:与酶中Cys-SH作用使人畜中毒。如有机砷化合物路易斯毒气(结构式见P375),可用含-SH的化合物作解毒剂,使酶恢复活性。

3.  氰化物、CO、H2S与含铁卟啉的酶,如细胞色素氧化酶中的Fe2+络合,使酶失活,阻止呼吸。

4.  青霉素:与糖肽转肽酶活性部位Ser-OH共价结合,使酶失活,(P375图9-24)抑制细菌细胞壁合成。青霉素与转肽酶的底物之一的酰基-D-Ala-D-Ala结构类似,见P546。

5.  TLCK:根据底物的化学结构设计的专一性不可逆抑制剂。以胰蛋白酶底物对甲苯磺酰-L-赖氨酰甲酯(TLME)为模板,设计底物结构类似物对甲苯磺酰-L-赖氨酰氯甲酮(TLCK)(结构见P376 图9-25),与胰蛋白酶活性部位His57共价结合,引起不可逆失活。

(2)  可逆抑制剂:

磺胺药:四氢叶酸(THF)是合成核酸和蛋白质酶的必需物质(辅酶)。根据人和细菌获THF途径不同设计磺胺类杀菌剂。叶酸(FA)结构见P377,DHF(二氢叶酸)、THF见P457 图11-30。

  FA还原酶  DHF还原酶

  叶酸  DHF  THF

(人可从食物中获取)  DHF合成酶

  对氨基苯甲酸(细菌靠此合成THF)

人体可直接从食物获取叶酸经DHF还原成THF而细菌只能从对氨基苯甲酸合成DHA。因此若抑制DHF合成酶,即可断绝细菌THF来源,从而抑制核酸和蛋白质的合成,而抗菌。

THF中对氨基苯甲酰胺部分的过渡态类似物对氨基苯磺酰胺可抑制DHF合成酶。

磺胺药抗菌谱广,性质稳定,对肺炎、痢疾等疗效显著。

此外抗癌药阿糖胞苷、氨甲喋呤等均为酶的竞争性抑制剂。

§2.10  温度、pH等对酶反应影响

(一)  酶反应最适温度:使酶促反应速度达最大值的温度,见P378 图9-28, 一般为钟罩形曲线。

每种酶在一定条件下都有其最适温度,动物一般35~400C,植物40~500C,微生物则差别较大,最高可达700C。

(二)最适pH:在此pH下酶促反应有最大速率。见P379 图9-29,钟罩形曲线。

一般酶最适pH在5~8之间,动物6.5~8.0,植物及微生物4.5~6.5。

(三)激活剂:凡是能提高酶活性的物质都称为激活剂,大部分是无机离子或简单有机化合物。

  不同的酶可有不同激活剂。

2.11  酶的作用机制  P384 

酶的活性部位

(1)酶活性部位:酶的特殊催化能力只局限在大分子的一定区域,活性部位又称活性中心。

酶分子中与酶活力直接相关的区域称为活性中心,分为:

①  结合部位:负责与底物结合,决定酶的专一性。

②  催化部位:负责催化底物键的断裂或形成,决定酶的催化能力。

  对需要辅酶的酶,辅酶分子或辅酶分子某一部分结构往往是酶活性部位组成部分。

(2)酶活性部位特点:

  1. 活性部位只占酶分子中相当小的部分,通常1~2%。P384 表10-1列举一些酶活性部位的氨基酸残基。如溶菌酶一共129个氨基酸残基,活性部位为Asp52和Glu35;胰凝乳蛋白酶241个残基,活性部位为His57,Asp102,Ser 195。

 2. 活性部位为三维实体。活性部位氨基酸残基在一级结构上可能相距甚远,甚至不在一条肽链上,但在空间结构上相互靠近。因此空间结构破坏酶即失活。活性中心以外部分可为酶活性中心提供三维结构。

3. 酶与底物的结构互补是指在酶和底物结合过程中,相互构象发生一定变化后才互补。如P385 图10-1。

4. 活性部位位于酶分子表面的一个裂缝内。裂缝中为一个疏水微环境,也含有某些极性氨基酸残基有利于催化,底物在此裂缝内有效浓度很高。

5. 酶与底物结合形成ES复合物主要靠次级键:氢键、盐键、范德华力和疏水相互作用。

6. 酶活性部位具有柔性和可运动性。

(一)研究酶活性部位的方法

(1)  酶侧链基团化学修饰法:

1. 特异性共价修饰:如二异丙基磷酰氟(DFP)专一地与酶活性部位Ser-OH的羟基共价结合,使酶失活。如胰凝乳蛋白酶共28个Ser,但DFP只与活性中心的Ser反应,见P386。反应后,用HCl将酶部分水解,得含二异丙基磷酸酯(DIP)基团的肽的片断,序列分析定出DIP-Ser为Ser195。

2. 亲和标记:用与底物结构相似的修饰剂,对酶活性部位进行专一性共价修饰。

如TPCK(结构式见P387),结构与胰凝乳蛋白酶的底物对甲苯磺酰-L-苯丙氨酸乙酯(TPE)类似,TPCK只与胰凝乳蛋白酶中His57结合,说明His57为该酶活性部位的一个氨基酸残基。

  (2) X-射线晶体结构分析:

  可提供酶分子三维结构,了解酶活性部位氨基酸残基所处相对位置与状态,与底物结合后酶分子在底物周围氨基酸残基排列状况,被作用键周围残基状况等。由此提出活性中心处氨基酸残基组成及催化作用形式。

 如溶菌酶:对它水解的糖苷键周围氨基酸残基分析后确定酶的催化基团为Glu35和Asp52。

 又如胰凝乳蛋白酶经X-射线晶体结构分析,表明活性部位由Ser195、His57和Asp102组成,并提出这三个氨基酸残基联在一起形成一个“电荷中继网”,如P409 图10-40所示: ① 没有底物时,His57未质子化,三联体排列为A;② 在加上底物后,Ser195转移一个质子给His57,带正电荷的咪唑环通过带负电荷的Asp102静电相互作用被稳定,成为B。详细酶作用机制见P410 图10-42。

(二)影响酶催化效率的有关因素:

(1)  底物和酶的邻近效应与定向效应。

酶催化反应高效率一重要原因是将分子间反应变为分子内反应。

邻近效应:底物与酶先形成中间体络合物,两分子成一个分子,分子内反应速度比分子间反应速度提高。P388 图10-2 所示:用咪唑催化乙酸对硝基苯酯水解来证实:咪唑可催化乙酸对硝基苯酯的酯键水解成乙酸和对硝基苯酚;若将咪唑分子先共价连接在底物上,在分子内催化酯键水解,可增速24倍。

定向效应:底物反应基团和酶催化基团正确取位会大大加速反应。P389 表10-3 用二羧酸单苯酯水解相对速度和结构关系实验表明:分子内催化反应,当催化基团羧基与酯键愈邻近并有一定取向,反应速度愈大。每移去一个旋转自由度,反应速度约增加200倍。

又如P389所示制备邻羟苯丙酸内酯的分子内酯化反应表明:当在分子中引入甲基使羧基和酚羟基定位,反应速率可提高2.5×1011倍。

(2)  底物的形变和诱导契合:

酶使底物分子内敏感键中某些基团的电子云密度增高或降低,产生“电子张力”,底物扭曲而接近过渡态,使反应加速。

如具有五元环构象的乙烯环磷酸酯(P390),由于构象更接近磷酸酯水解时的过渡态,P-O键有电子张力,因此水解速度是磷酸二甲酯的108倍。

溶菌酶作用细菌细胞壁,水解由N-乙酰基葡萄糖胺等构成的糖苷键。溶菌酶与底物结合时会引起糖环构象由椅式变成半椅式,可加速水解。

(3)  酸碱催化:

酶为广义酸碱催化。咪唑基既是一个强亲核基团,又是一个有效的广义酸碱催化功能基团,因此蛋白质中His含量虽少,但却占有重要的地位。此外酶蛋白中还有氨基、羧基、巯基、羟基等,都具有广义酸碱催化功能。

(4)  共价催化:

有亲核催化或亲电催化。酶在催化过程中形成中间物,P392 表10-5列出形成共价中间物的一些酶。

酶分子中氨基酸侧链上有许多亲核基团如羟基、巯基、咪唑基等,可进攻底物的酰基、磷酰基和糖基等。

(5)  金属离子催化:

几乎三分之一的酶催化需要金属离子,金属离子可以与酶紧密结合,也可以是松散结合。

①  金属作用与H+相似,但由于带正电荷更多而作用更强,且容易维持一定浓度。② 金属离子可通过电荷屏蔽作用而促进反应。如Mg++屏蔽ATP中磷酸基负电荷,消除负电荷排斥作用而加速激酶的反应,此时激酶真正作用底物是Mg2+-ATP,而不是ATP,见P394。③ 金属离子通过水的离子化,使水分子更具酸性,促进亲核催化。④ 许多氧化还原酶都含有金属的辅基。

(6)  多元催化和协同效应:

酶催化反应时常常是几个功能团适当排列共同作用。如胰凝乳蛋白酶活性中心处三个氨基酸残基组成“电荷中继网”,催化肽键水解;核糖核酸酶催化水解时,His12起广义碱催化作用,接受一个质子,而His119起广义酸作用,和磷酸的氧原子形成氢键。

亚胺内酯水解:在咪唑缓冲液中得酰胺,而在磷酸缓冲液中,尽管pH相同产物却为胺和酯,其区别即为磷酸盐双功能催化。

(7)  微环境影响:

酶促反应在酶表面的疏水裂缝(活性中心)中进行,如同反应在有机溶剂中进行,反应基团不为溶剂化,亲核亲电反应均可加速。如溶菌酶Glu35的羧基在非极性区,催化功能增速3×106倍。模拟酶由此设计胶束模拟酶和环糊精等。

(三)酶催化反应机制实例:

溶菌酶(Lysozyme,EC3.2.1.17)是第一个用X-衍射阐明结构和功能的酶。生物功能为催化某些细菌细胞壁多糖的水解,结构如P395图 10-9所示。

细胞壁是由NAG(N-乙酰氨基葡萄糖)和NAM(N-乙酰氨基葡萄糖乳酸)通过β(1→4)糖蔗键交替排列而成的多糖。溶菌酶底物为NAG-NAM交替的六糖,可表示为ABCDEF。

(1)  在酶活性部位凹穴中,底物受酶影响D-环发生变形,糖环构象从椅式变成能量较高的半椅式或船式,接近过渡态构象。

(2)  酶活性基团处于非极性区的Glu35的羧基不解离,提供一个H+到D环与E环间的糖苷键上氧原子上,D环上的C1与氧原子间的糖苷键断开,形成正碳离子(SP2)过渡态中间物,并为处于极性区的活性基团Asp52上的羧基负离子所稳定。六糖中的E及F两糖残基成HO-EF离开,如P398图 10-16所示。

(3)  正碳离子中间产物进一步与来自溶剂中的-OH反应,解除SP2张力,ABCD四糖残基离开酶分子,Glu35同时质子化恢复原状。如P399图 10-17所示。

(4)  至次一次反应完成,细胞壁打开一个缺口。

第三章  氨基酸分解代谢  下册P299 

细胞总是不断地从氨基酸合成蛋白质,又把蛋白质降解为氨基酸,由此可排除不正常蛋白质,排除积累过多的酶和“调节蛋白”,使细胞代谢得以正常进行。对正常蛋白质细胞也要进行有选择的降解。蛋白质降解为氨基酸后氨基酸会继续进行分解代谢。

§3.1  氨基酸分解代谢(P303):

氨基酸的分解代谢总是先脱去氨基。脱氨基的方式,不同生物不完全相同。氧化脱氨基作用普遍存在于动植物中,非氧化脱氨基作用主要见于微生物。陆生脊椎动物将脱下的氨基合成尿素,脱氨后的氨基酸碳骨架进行氧化分解,形成能进入柠檬酸循环的化合物,最后氧化成CO2和H2 O。

(一) 氨基酸的脱氨基作用:

绝大多数氨基酸脱氨基出自转氨基作用,氨基酸与α-酮戊二酸在氨基转移酶作用下发生氨基酸脱氨同时生成Glu(也有的转到草酰乙酸上生成Asp)。

(1) 氨基转移反应分两步进行:

1.  氨基酸先将氨基转移到酶分子的辅酶磷酸吡哆醛(PLP)上,自身形成α-酮酸,PLP则形成磷酸吡哆胺(PMP)。

2.PMP的氨基转移到α-酮戊二酸(或草酰乙酸)上,生成Glu(或Asp),PLP恢复。

  详细机制可见P305 图30-3。

(2)转氨酶:

已发现有50种以上的转氨酶,大多数需要α-酮戊二酸为氨基受体。

1.  丙氨酸转氨酶(ALT),又称谷丙转氨酶(G..P.T),主要存在于肝细胞浆中,用于诊断肝病。

2.   天冬氨酸转氨酶(AST),又称谷草转氨酶(G..O.T),在心、肝中含量丰富,可用于测定心肌梗死,肝病。

人体转氨酶以ALT和AST活力最高。

(二)氧化脱氨基作用

  在氧化脱氨基作用中以谷氨酸脱氢酶活性最高,该酶以NAD(P)+为辅酶,使Glu经氧化作用,脱2H,再水解脱去氨基,生成α-酮戊二酸,如P306 图30-4所示。

  谷氨酸脱氢酶由6个相同的亚基构成,分子量为33万,是变构调节酶,被GTP和ATP抑制,被ADP激活。活性受底物及产物浓度左右。

(三)联合脱氨基作用

  氨基酸脱氨基重要方式是联合脱氨基作用。

(1)  氨基酸的α-氨基借助转氨作用转移到α-酮戊二酸的分子上,生成相应的α-酮酸和Glu,然后Glu在谷氨酸脱氢酶催化下,脱氨基生成α-酮戊二酸,同时释放出氨(P307图30-5)。

此过程在肌体中广泛存在。

(2)  嘌呤核苷酸的联合脱氨基作用:次黄嘌呤核苷酸与Asp作用形成中间产物腺苷酸琥珀酸,后者在裂合酶作用下分解成腺嘌呤核苷酸和延胡索酸,腺嘌呤核苷酸水解生成游离氨基酸和次黄嘌呤核苷酸(P307图30-6)。

此过程在骨骼肌、心肌、肝脏及脑中存在。

(四)氨基酸的脱羧基作用

在脱羧酶催化下生成相应的一级胺,产物常有重要生理作用。

  Glu → r-氨基丁酸,神经递质,抑制神经。

  His → 组氨,降血压,刺激胃液分泌。

  Tyr → 酪氨,升高血压。

(五)氨的命运

  氨对生物机体有毒,脑对氨极为敏感,血液中含1%的氨就可引起中枢神经系统中毒。因此生物体必须排泄氨。

  水生动物直接排氨,大多数陆生动物排尿素,鸟类和陆生爬行动物排尿酸(结构式见P309)。

  [氨的转运]:

(1)  主要通过Glu,反应如下:

  谷氨酸合成酶

Glu + NH4+ + ATP  Glu + ADP + Pi + H+

Glu为中性物质,易透过细胞膜,由血液到肝脏,在肝细胞中在谷氨酰胺酶作用下分解成Glu和NH3。Glu是体内氨的一种运输、储存形式,也是氨的暂时解毒方式。

(2)  在肌肉中可通过葡萄糖—丙氨酸循环,通过Ala则更经济。肌肉在活动时消耗糖产生能量时会产生大量丙酮酸,同时产生氨。两者都需要运送到肝脏中进一步转化,而先将两者转化成Ala再转运到肝脏十分经济。在肝脏中Ala与α-酮戊二酸反应生成丙酮酸和Glu,丙酮酸经葡糖异生生成葡萄糖,经血液到肌肉中,再供产生能量使用,由此形成循环。

§3.2  尿素的形成

尿素中的两个NH2,一个由Glu联合脱氨产生,另一个NH2来自Asp。羰基来自CO2,由柠檬酸循环产生。

  尿素在形成过程中是以鸟氨酸为载体形成尿素循环。在尿素循环中,一分子鸟氨酸和一分子氨及CO2结合形成瓜氨酸,瓜氨酸与另一分子氨形成精氨酸,Arg水解形成尿素和鸟氨酸,完成一次循环。尿素循环包括有5步酶反应,2步发生线粒体内,3步发生在细胞溶胶中,如P311 图30-9所示。

(1)  氨甲酰磷酸合成(第一个氮原子获取):

   氨甲酰磷酸合成酶

2ATP + HCO3 -+ NH+4 + H2O  H2NCOOPO32-

α-酮戊二酸  (氨甲酰磷酸)

Glu

+ 2ADP + Pi  反应中消耗2分子ATP

(2)  瓜氨酸生成:

  鸟氨酸转氨甲酰基酶

H2NCOOPO32- + 鸟氨酸  瓜氨酸 + Pi

(3)  瓜氨酸离开线粒体中,进入细胞溶胶,反应生成精氨琥珀酸(尿素中第二氮原子获取)。  COO-  NH2+   NH3+

  精氨琥珀酸合成酶  ∣   ‖  ∣

瓜氨酸 + Asp + ATP  -OOCCH2CHNH-C-NH-(CH2)3CHCOO-  (精氨琥珀酸) + AMP + PPi

(4)  精氨酸形成:

   CHCOOH

  精氨琥珀酸裂解酶  ‖

精氨琥珀酸  Arg + HOOCCH(延胡索酸)

生成的延胡索酸为柠檬酸循环中间产物,将尿素循环和柠檬酸循环联系起来。

(5)  尿素形成:

  精氨酸酶

Arg + H2O  鸟氨酸 + 尿素

鸟氨酸进入下一循环。

总反应耗能,使用3个ADP,生成2个ADP,1个AMP。总的消耗4个高能键,但在Glu脱氢生成NH3时,产生一分子NADH,可放能。

尿素循环若出现问题,会发生“高血氨症”,使人智力迟钝,神经发育停滞,以至死亡。

§3.3 氨基酸碳骨架的代谢  P314

20种氨基酸碳骨架,由20种不同的多酶体系进行氧化分解,最后集中形成5种产物进入柠檬酸循环。这5种产物均为TCA的中间体。

柠檬酸循环(又称三羧酸循环,TCA)是糖、脂肪、蛋白三大物质代谢的共同通路,自乙酰辅酶A起,经柠檬酸等几个三羧酸,最终氧化成CO2和水,20种氨基酸碳骨架氧化分解形成的5种产物: ① 乙酰辅酶A(包括丙酮酸,乙酰乙酰辅酶A),涉及的氨基酸为Ala、Thr、Gly、Ser、Cys、Phe、Tyr、Leu、Lys和Trp等十种,简称C3族。 ② α-酮戊二酸,涉及的氨基酸为Arg、His、Gln、Pro和Glu等五种,简称C5族。 ③ 琥珀酰辅酶A,涉及的氨基酸为Ile、Met和Val等三种。 ④ 延胡索酸,涉及的氨基酸为Phe和Tyr,它们除可生成乙酰辅酶A外还可代谢成延胡索酸。 ⑤ 草酰乙酸,涉及氨基酸为Asp和Asn,可简称C4族。祥见P315 图30-13,氨基酸碳骨架进入TCA途径。

从图中可看出:

(1)  C3族:A、T、G、S、C五种氨基酸经丙酮酸而形成乙酰辅酶A;F、Y、L、K、W五种氨基酸经乙酰乙酰辅酶A再形成乙酰辅酶A。

(2)  C5族:R、H、Q、P四种氨基酸通过E转变成α-酮戊二酸。

(3)  I、M、V三种氨基酸经琥珀酰辅酶A进入TCA。

(4)  F、Y还可以被氧化酶降解为延胡索酸进入TCA。

(5)  C4族:D、N经草酰乙酸进入TCA。

§3.4  生糖氨基酸和生酮氨基酸:

生糖氨基酸:能增加尿中葡萄糖排出量,包括能生成丙酮酸,α-酮戊二酸、琥珀酸和草酰乙酸的氨基酸。

生酮氨基酸:能增加尿中酮体排出量的氨基酸,包括在分解过程中转变成乙酰乙酰辅酶A的氨基酸(可进一步生成乙酰乙酸和β-羟丁酸)。

生酮生糖氨基酸:既可生成酮体又可生成糖,如Phe和Tyr。

生酮、生糖氨基酸界限并不十分严格,只Leu为纯粹生酮氨基酸。

糖尿病人尿中酮体除来源于脂肪酸外,还来源于生酮氨基酸。

§3.5  由氨基酸衍生的重要物质:

(一)氨基酸与一碳单位:

  许多氨基酸都可作为一碳单位来源,如Gly、Thr、Ser和His等。一碳单位与氨基酸代谢、嘌呤和嘧啶生物合成以及S-腺苷甲硫氨酸(甲基提供者)生物合成有关。一碳单位转移靠四氢叶酸。

(二)氨基酸与生物活性物质:

由氨基酸来源的生物活性物质如P332 表30-2所示。

(1)氨基酸代谢:

黑色素生成:

Tyr在酪氨酸羟化酶作用下氧化生成二羟苯丙氨酸(多巴),再在酪氨酸催化下氧化成苯丙氨酸-3,4-醌(多巴醌),然后聚合成黑色素。反应见333 图30-34。

黑色素过多产生雀斑、老年斑,过少则为白癜风等白化病,用酪氨酸酶抑制剂可治疗黑色素过多,用激活剂可治疗白化病。

酪氨酸产生儿茶酚胺类物质:

Tyr在酪氨酸羟化酶作用下氧化成多巴,在芳香族氨基酸脱羧酶作用下失羧生成二羟苯乙胺(多巴胺),然后在多巴胺-β-羟化酶作用下氧化生成1-(3,4-二羟苯基)-2-氨基乙醇(去甲肾上腺素或称正肾上腺素),最后在苯乙醇胺-N-转甲基酶作用下甲基化生成肾上腺素,化学名称1-(3,4-二羟苯基)-2-甲胺基乙醇。祥见P333 图30-35。

肾上腺素和去甲肾上腺素均为交感神经末梢的化学介质,使交感神经兴奋,对心脏、血管有生理作用,使血管收缩、血压急剧上升,为含氮激素。肾上腺素使血糖升高,促进蛋白、氨基酸和脂肪分解,使肌体应付意外情况。

拟肾上腺素:可代替肾上腺素的药。

麻黄碱(N-甲胺基-1-苯基丙醇),为苯丙胺(PPA)类化合物,还原失水为“冰毒”。麻黄碱生理功能与肾上腺素相似,但有副作用。

  4. 抗肾上腺素:肾上腺素受体分为α-受体和β-受体。β-受体阻断剂:心得宁、心得安可抗心率失常,使心率减慢。

(2)色氨酸代谢产物:

色氨酸失羧得5-羟色胺。见P334 图30-36。

5-羟色胺(5-HT)是脊椎动物的一种神经递质,含量与神经兴奋和抑制状态有关,也是血管收缩素,可使心率增加,肠道、支气管收缩。5-HT拮抗药,可医治肠道运动亢进。

吲哚乙酸:为Trp脱氨、失羧氧化后产物。见P334,为植物生长激素。

松果体素:由5-HT乙酰化、甲基化而得。可促进老年人睡眠和调时差。

(3)  组氨酸代谢产物组胺:

由His脱羧而得,见P334,可使血管强烈舒张,作用血管平滑肌,抗组氨药(阻断组胺与受体结合),有镇静催眠作用。

(4)  牛黄酸:

氨基乙磺酸,为Cys氧化脱羧产物,是一种抑制性神经递质。

§3.6  氨基酸代谢缺陷症

  氨基酸代谢中缺乏某一种酶,都可引起症患,为代谢缺陷症,是分子疾病。病因和DNA分子突变有关。已发现氨基酸代谢病30多种,如P336 表30-3所示。如苯丙酮尿症,缺少苯丙氧酸单加氧酶;尿黑酸症,缺乏尿黑酸氧化酶。

第四章  氨基酸及其重要衍生物的生物合成

  下册P340  31章

§4.1  概论

不同生物合成氨基酸的能力不同,合成氨基酸的种类也有很大差异。

必需氨基酸:肌体维持正常生长所必需而又不能自己合成,需从外界获取的氨基酸。

人和大白鼠需以下十种氨基酸(由大白鼠喂饲试验得来):Phe、Lys、Ile、Leu、Met、Thr、Trp、Val、(His、Arg)。

对于成人为前八种,对幼小动物为十种。

非必需氨基酸:肌体可以通过其他原料自己合成的氨基酸。

高等植物可以合成自己所需氨基酸。微生物合成氨基酸能力有很大差距。E.coli可合成所需氨基酸,乳酸菌则不能合成。

§4.2  氨基酸生物合成途径:

可用为生物遗传突变株研究。使突变株在氨基酸的某个合成环节上产生缺失,造成某种中间物积累,从而判明各个中间代谢环节,由此已阐明20种氨基酸的生物合成途径。

在生物合成中,氨基酸的氨基多来自Glu的转氨基反应,而各种碳骨架起源于TCA、糖酵解等代谢途径,由此划分为若干类型。根据生物合成起始物的不同,可将氨基酸生物合成途径归纳为六族。

P341 图31-1为氨基酸生物合成的分族情况: ① 谷氨酸族 ② 天冬氨酸族 ③ 丝氨酸族 ④ 丙氨酸族 ⑤ 芳香氨基酸族 ⑥ 组氨酸。P341图31-2为20种氨基酸生物合成概貌。

(一)谷氨酸族氨基酸的生物合成:

均以α-酮戊二酸为前提。α-酮戊二酸形成Glu后可生成Gln、Pro和Arg(P344,P345 图31-6,P346 图31-7);在真菌中还可生成Lys(P347图31-8)。

(二)天冬氨酸族氨基酸的生物合成:

草酰乙酸生成Asp后可生成Asn,经天冬氨酸β-半醛可生成Lys(P349图31-9),再经高丝氨酸可生成Thr,进一步生成Ile,还可生成Met(P350图31-10,P351 图31-11,图31-12)。

(三)丙氨酸族氨基酸的生物合成:

丙酮酸可直接生成Ala,经α-酮异戊酸可生成Val和Leu(P352 图31-13,P353 图31-15)。

(四)丝氨酸族氨基酸的生物合成

以甘油酸-3-磷酸(酵解中间产物)为出发点合成Ser,然后合成Gly和Cys(P354图31-16,图31-17,P355 图31-19)。

(五)芳香族氨基酸的生物合成

合成起始物为磷酸烯醇丙酮酸与赤藓糖-4-磷酸,经莽草酸→分支酸→予

   (P358图31-22)

  Trp

苯酸而生成Phe和Tyr(P356 图31-20,P357 图31-21)。

(六)组氨酸的生物合成

5-磷酸核糖-1-焦磷酸(5-PRPP)经10步反应生成His(P360 图31-23)。

§4.3  氨基酸转化为其他氨基酸及其代谢物

(一)氧化氮的形成

NO是脊椎动物体内一种重要的信息分子,在信号传导过程中起重要作用,它是由Arg在氧化氮合酶催化下形成的(P363)。NO可自由跨膜扩散,非常适合在细胞内部以及细胞之间作为瞬间的信号分子,一般只存在几秒钟。

(二)谷胱甘肽

(1) 结构式见P364还原型谷胱甘肽,注意是γ-Glu的γ-COOH与Cys的氨基形成肽键。  SH

  ∣ 

还原型谷胱甘肽简写为γ-Glu-Cys-Gly,或GSH

氧化型谷胱甘肽简写为γ-Glu-Cys-Gly,或GSSG

  ∣

 S

 ∣

S

γ-Glu-Cys-Gly

  GSSG在谷胱甘肽还原酶催化下还原成GSH

(2)  作用:

1.  GSH保护血液中红细胞,维持血红素中的Cys处于还原态。正常情况下GSH:GSSG 500:1,谷胱甘肽起到巯基缓冲剂作用。

2.  GSH起解毒作用,可清除H2O2或有机氧化物。

3.  参与氨基酸转运,经γ-谷氨酰循环,帮助氨基酸完成跨膜吸收,生成γ-谷氨酰氨基酸,使氨基酸从膜外转运到细胞内被细胞吸收。见P364 图31-27。

(三)肌酸的生物合成:

结构式及肌酸的合成见P366 图31-28,磷酸肌酸见P35(下册)。

肌酸含N-P高能键,在肌肉和神经的贮能中占有重要地位。

(四)卟啉、血红素的生物合成:

(1)  卟啉是以Gly和琥珀酰CoA为原料合成的,见P366,先合成3-氨基乙酰丙酸。

(2)  二个3-氨基乙酰丙酸再缩合、脱水环化生成胆色素原,P368。

(3)  四个胆色素原分子在胆色素原脱氨酶作用下脱去3分子NH3生成线型四吡咯,P369。

(4)  线型四吡咯环化脱NH3生成尿卟啉原Ⅰ,结构式见P369 图31-32。

(5)  血红素合成:

结构式见P371 图31-37。血红素降解后产物为胆红素,结构见P371图31-38。胆红素是体内过氧化物的有效清除剂,是血浆中三种主要的抗氧化剂之一。血液中胆红素浓度升高,皮肤、眼球变黄。

胆红素可从动物胆、肝中提取,为配制人工牛黄重要原料。

第五章  糖与糖代谢

§5.1  糖的生物学作用:  上册P1  (1章)

糖类是细胞中非常重要一类物质,在几乎所有重要生理过程中都有举足轻重的作用。

(一)糖的生物学作用:

(1) 生物体的结构成分:动植物躯壳,如纤维素和甲壳素(昆虫和甲壳类动物的外骨骼)。

(2)  能源物质:贮存能源的糖类,如淀粉、糖原和葡萄糖。

(3) 转变为其他物质(碳源物质):为合成其他生物分子如氨基酸、核苷酸和脂肪酸等提供碳骨架。

(4) 作为细胞识别的信息分子:大多数蛋白质是糖蛋白,如免疫球蛋白、激素、毒素、凝集素、抗原以至酶和结构蛋白。在糖蛋白中起信息分子作用的为糖链。如B-型血外端的半乳糖用α-半乳糖苷酶(来自海南产的咖啡豆中)切除掉,则B-抗原活性丧失,呈现O-型血的典型特征。

糖在几乎所有重要生理过程中都有举足轻重的作用。

1.  生命开始,卵细胞受精、细胞凝集、胚胎形成,细胞的运转和粘附。

2.  细胞间的相互识别,通讯与相互作用。

3.  免疫保护(抗原与抗体),代谢调控(激素与受体),形态发生、发育,器官的移植。

4.  癌症发生与转移,衰老、病变等过程。

糖是生物体内重要信息物质,在细胞识别、信号传递与传导、免疫过程、细胞通讯和代谢调控中都扮演重要作用。糖生物学已发展成为生命科学研究的重要内容。

(二)糖的结构特点:

糖的分子结构比蛋白质和核酸复杂。如葡萄糖有4个不对称碳原子,成环后C1又形成α、β两个异头体结构,葡萄糖同分异构体有25=32个。结构复杂多样的糖分子成为携带生物信息的极好载体。多肽与核酸携带信息仅依赖于其组成单体的种类、数量和连接顺序,而糖链携带信息除单体种类、数量和排列外还有分支结构和异头碳构型。因此糖的聚合体单位重量携带的信息量比蛋白质和核酸大的多。

(三)糖工程:

糖工程即糖类药物的研究,包括药用寡糖及类似物的合成,糖蛋白及糖脂中糖的改性修饰,糖与蛋白的联结等内容。糖类药物的研究与开发在极快发展,如“抗粘附”类寡糖药物的研究,其原理为细胞感染首先是入侵病原体表面的糖蛋白(粘附蛋白)识别正常人细胞表面的寡糖(配体),继而发生粘附作用。若引入与寡糖结构(配体)相同或类似的游离寡糖,并使它们与病原体上的粘附蛋白结合即可避免病原体对细胞的感染,而成为“抗粘附”类寡糖药物,此类药物在与病原体的粘附蛋白结合后会被排出体外而防止感染。如已开发出对付幽门螺旋杆菌的药物,可防治胃炎、胃溃疡和十二指肠溃疡;已鉴定了与人体发炎过程及癌细胞转移密切相关的粘附蛋白E-Selectin中四糖的结构等。

糖工程研究内容首先进行天然产物(如粘附蛋白)的分离和纯化,然后进行微量寡糖的分析,确认结构,最后进行寡糖的合成,为此已发展了寡糖的液相和固相合成。寡糖结构的复杂性使糖工程研究过程中困难重重,如三个结构相同的己糖形成三糖会有120种不同连接,使分析、分离工作面临挑战。

§5.2  糖酵解作用:下册  P63  22章

无氧条件下葡萄糖进行分解,1个葡萄糖分子形成2分子丙酮酸并提供能量的过程称为糖酵解作用。

机体生存需要能量。机体内主要提供能量的物质是ATP,ATP的结构见P37。ATP~ADP循环是生物体系中能量交换基本方式。

糖酵解过程是生物最古老、最原始获得能量的一种方式,通过酵解可以在无氧或供氧不足时给机体提供能量。酵解在细胞胞液中进行。

糖酵解:葡萄糖在无氧条件下转变为丙酮酸所经历的一系列反应,在此过程中净生成2个ATP分子。

无氧条件下丙酮酸由NADH还原成乳酸,高等动物肌肉组织中糖酵解最终产物为乳酸。

发酵分为乳酸发酵和乙醇发酵。微生物经过无氧条件产生乳酸的过程称为乳酸发酵;包括丙酮酸脱羧生成乙醇的发酵过程称为乙醇发酵,其基本路线和酵解完全相同,只是在形成丙酮酸后才有差异。

(一)糖酵解和乙醇发酵全过程:

如P67 图22-1所示,分两阶段进行:

1. 准备阶段:1分子葡萄糖经磷酸化成2分子三碳糖,消耗2分子ATP。

2. 放能阶段:磷酸三碳糖变成丙酮酸,2个三碳糖分子产生4个ATP。

糖酵解过程由葡萄糖到所有的中间产物都是以磷酸化合物的形式来实现的。

发酵在生物化学发展过程中有重要意义。当把酵母汁液加入蔗糖中发酵产生乙醇,证明发酵可在活细胞外进行,打开了现代生物化学大门,新陈代谢变为化学。

第一阶段:

(1)  葡萄糖在己糖激酶催化下磷酸化形成葡萄糖-6-磷酸。

  己糖激酶

葡萄糖 + ATP  葡萄糖-6-磷酸 + ADP

(G)  (G-6-P)

肝脏中则由专一性强的葡萄糖激酶催化。

反应消耗1分子ATP,己糖激酶为调控酶。该步反应受产物G-6-P和ADP抑制。

 (2)G-6-P异构化成果糖-6-磷酸(F-6-P)。

  磷酸葡萄糖异构酶

G-6-P  F-6-P

反应可逆,反应为酶促广义酸碱催化,见P70 图22-3。

 (3)F-6-P形成F-1,6-2P(果糖-1,6-二磷酸)。

  磷酸果糖激酶

F-6-P + ATP  F-1,6-2P + ADP

又消耗1分子ATP,作用机制与己糖激酶同,如P71 图22-4所示。

此步为调控酶,为限速步骤。

该酶为ATP(反应物)所抑制,又可为AMP解除。ATP/AMP比例对酶有明显调节作用。

 (4)F-1,6-2P转变成G-3-P(甘油醛-3-磷酸)和DHAP(二羟丙酮磷酸)。

  醛缩酶

F-1,6-2P  DHAP + G-3-P

为羟醛缩合反应逆反应,机制见P73 图22-5。

 (5)DHAP异构化成G-3-P。

  磷酸丙糖异构化酶

DHAP  G-3-P

至此准备阶段完成两个磷酸化步骤,六碳糖变成两个G-3-P,消耗2个ATP。

第二阶段:

 (6)G-3-P氧化成1,3-BPG(1,3-二磷酸甘油酸)。

  甘油醛-3-磷酸脱氢酶

G-3-P + NAD+ + H3DO4  1,3-BPG + NADH + H+

①  此步醛基氧化释放能量,形成高能酰基磷酸。

②  此步可为砷酸盐破坏。砷酸在结构和反应方面与磷酸相似,可代替磷酸产生1-砷酸-3-磷酸甘油酸,不稳定而迅速水解成3-磷酸甘油酸,使氧化释放的能量不能贮存。

③  此步需NAD+,产生NADH+ H+,NAD+需要再生。

有氧时,NADH可经氧化呼吸链氧化成NAD+。

无氧时,可利用酵解产物丙酮酸氧化NADH成NAD+,丙酮酸还原成乳酸,以保证酵解过程继续进行。

 (7)1,3-BPG转移高能磷酸基团形成3-磷酸甘油酸(3-PG)。

  磷酸甘油酸激酶

1,3-BPG + ADP  3-PG + ATP

第一次产生ATP,一个六碳糖产生两个三碳糖,因此一共产生2个ATP。

 (8)3-PG转变成2-磷酸甘油酸(2-PG)。

  磷酸甘油酸变位酶

3-PG  2-PG

为分子内重排反应。

 (9)2-PG脱水生成磷酸烯醇式丙酮酸。

  烯醇化酶

2-PG  磷酸烯醇式丙酮酸 + H2O

(10)  磷酸烯醇式丙酮酸转变成丙酮酸,并产生1分子ATP。

  丙酮酸激酶

磷酸烯醇式丙酮酸 + ADP + Pi  丙酮酸 + ATP

反应不可逆,酶为调控酶,第二次产生ATP。

(二)酵解过程中能量转变估算:

酵解过程为一个葡萄糖分解为两分子丙酮酸。

葡萄糖 + 2Pi + 2ADP + 2NAD+ →2丙酮酸 + 2ATP + 2NADH + 2H+ + 2H2O。

净产生2分子ATP。

(三)丙酮酸去路:

在无氧情况下,酵解进行必须使NAD+从NADH再生,不断提供NAD+。

 (1)生成乳酸:

  乳酸脱氢酶

丙酮酸 + NADH + H+   乳酸 + NAD+

此时每分子葡萄糖在无氧下代谢形成2分子乳酸,反应为:C6H12O6 + 2ADP + 2Pi→2C3H6O3 + 2ATP + 2H2O。

(乳酸)

(2)  生成乙醇:

酵母在无氧条件下将丙酮酸变为乙醇和CO2。

  丙酮酸脱羧酶

丙酮酸  乙醛

  乙醇脱氢酶

乙醛 + NADH + H+  乙醇 + NAD+

(3)  丙酮酸还可经乙酰CoA进入TCA,经糖的异生转化为Ala。

小结:糖酵解反应涉及的10个酶

ATP变化  备注

 (1)己糖激酶(肝内为葡萄糖异构酶) ―1  调控酶

 (2)磷酸葡萄糖异构酶

 (3)磷酸果糖激酶  ―1  调控酶

(4)  醛缩酶

(5)  磷酸丙糖异构酶

(6)  甘油醛-3-磷酸脱氢酶  需NAD+

(7)  磷酸甘油酸激酶  +2

(8)  磷酸甘油酸变位酶

(9)  烯醇化酶

(10)丙酮酸激酶  +2  调控酶

§5.3  柠檬酸循环:  下册  P92  23章

酵解产生的丙酮酸在有氧条件下,继续进行有氧分解最后形成CO2和水,并产生ATP,经历途径分为两个阶段,分别为柠檬酸循环和氧化磷酸化。

柠檬酸循环又称三羧酸循环(TCA),又称Krebs循环,在细胞线粒体中进行。TCA是糖、脂类和氨基酸代谢的最后共同途径,其中间体可作为许多生物合成的前体。

丙酮酸通过TCA进行脱羧和脱氢反应,羧基形成CO2,氢原子则随载体(NAD+、FAD)进入电子传递链,经过氧化磷酸化作用形成水分子,并将释放的能量用于合成ATP。

(一)准备阶段:丙酮酸形成乙酰CoA

   酶

丙酮酸 + CoASH + NAD+  乙酰CoA + CO2 + NADH + H+

酶为丙酮酸脱氢酶复合体,进行氧化还原和脱羧反应。该酶系实际为三种酶:丙酮酸脱氢酶、二氢硫辛酰转乙酰基酶和二氢硫辛酸脱氢酶,催化4步反应,有5个辅助因子:CoA,NAD+,TPP,硫辛酰胺和FAD。

(二)柠檬酸循环概貌: 见P97 图23-2

(三)柠檬酸循环的8个步骤:见P99~P106

(1) 草酰乙酸与乙酰CoA缩合形成柠檬酸。

   柠檬酸合成酶

  草酰乙酸 + 乙酰CoA + H2O  柠檬酸 + HSCoA + H+

  为酯缩合反应,酶为调控酶,受ATP,NADH,琥珀酰CoA等抑制,此步为TCA中限速步骤。

  氟乙酰胺、氟乙酸可形成氟柠檬酸,为致死性合成反应。

(2)柠檬酸异构化形成异柠檬酸。

  ―H2O  +H2O

  柠檬酸  顺乌头酸  异柠檬酸

  酶为乌头酸酶,反应可逆。

(3)异柠檬酸氧化形成α-酮戊二酸。

  异柠檬酸脱氢酶  ―CO2

  异柠檬酸 + NAD+  草酰琥珀酸  α-酮戊二酸

  (NADP+)

异柠檬酸脱氢酶为变构调节酶,有两种,分别以NAD+或NADP+为辅酶。

(4)α-酮戊二酸氧化脱羧形成琥珀酰CoA。

  酶

α-酮戊二酸 + NAD+ + CoASH  琥珀酰CoA + NADH + H+ + CO2

酶为α-酮戊二酸脱氢酶系,此多酶复合体为调控酶,反应与丙酮酸氧化脱羧相似。

(5)琥珀酰CoA转变成琥珀酸,并产生一个高能磷酸键(GDP → GTP)。

  琥珀酸CoA合成酶

琥珀酰CoA + GDP + Pi   琥珀酸 + CoASH + GTP

一个GTP相当一个ATP。

(6)琥珀酸脱氢形成延胡索酸。

  琥珀酸脱氢酶

琥珀酸 + FAD  延胡索酸 + FADH2

(7)水合形成L-苹果酸。

  延胡索酸酶

延胡索酸 + H2O  L-苹果酸

(8)L-苹果酸脱氢形成草酰乙酸(供下轮循环使用)。

  L-苹果酸脱氢酶

L-苹果酸 + NAD+  草酰乙酸 + NADH + H+

柠檬酸循环见P98 图23-3。

放射性同位素实验证明,TCA脱下的羧基是原来在草酰乙酸分子上的羧基,形成的草酰乙酸为新的草酰乙酸。

(四)柠檬酸循环的化学总结算

TCA总反应为:

CH3COSCoA + 3NAD+ + 2H2O + GTP + Pi + FAD→2CO2 + 3NADH + FADH2 + GTP + 2H+ + CoA SH

乙酰CoA经TCA产生3个NADH,1个FADH2和1个GTP(ATP)。两个碳以CO2形式离开,4个氢原子形成3分子NADH,1分子FADH2。

柠檬酸循环只能在有氧条件下进行,因为产生的3个NADH和1个FADH2只能经电子传递链被氧化成NAD+和FAD而再生。经电子传递链NADH被氧化产生2.5ATP,FADH2被氧化产生1.5ATP。3个NADH,1个FADH2共产生3×2.5 + 1.5 = 9个ATP,再加上1个GTP共产生9 + 1 = 10个ATP。

从丙酮酸脱氢开始计算,每分子丙酮酸氧化脱羧产生1个NADH,合2.5个ATP,所以从丙酮酸开始TCA一次循环共产生12.5个ATP。

从葡萄糖开始,经酵解,1分子葡萄糖产生2分子丙酮酸,2个ATP及2个NADH,再经柠檬酸循环共产生12.5×2 = 25个ATP。

所以1分子葡萄糖经酵解,TCA及氧化磷酸化共产生ATP分子数为:25 + 7 =32个ATP。

(五)柠檬酸循环双重作用:

TCA即是主要的分解代谢途径,提供ATP,又是许多合成代谢中间产物前体的来源。TCA具有分解代谢和合成代谢的双重性,如P110 图23-14所示。

(六)柠檬酸循环的发现:(略)

Krebes参加了此项工作,并因此获若贝尔奖。

5.4  生物氧化----电子传递和氧化磷酸化作用   下册  P114  第24章

  生物体所需能量大都来自糖、脂肪、蛋白质等有机物的氧化

  (1)先进行分解代谢,代谢物脱氢,辅酶NAD+或FAD还原成NADH或FADH2(携带 

  氢离子和电子。

  (2)氢离子和电子都经过相同的一系列电子载体传递过程传递给氧。

  (3)产生的能量一般都贮存在ATP等特殊化合物中。

  生物氧化实质上是氧化磷酸化,发生在线粒体内膜。

  氧化磷酸化:NADH或FADH2上的电子通过进行一系列电子传递载体传递给O2,伴

随NADH和FADH2的氧化释放的能量使ADP磷酸化形成ATP。

(一)氧还原电势

生物体系中进行氧化还原时其基本原理和化学电池一致。

生物体内一些重要物质的标准氢化还原电势如P117表24-1所示。

如:NADH被O2氢化。

电极反应:1/2 O2+2H++2e- == H2O  E0=+0.815。

  NAD++2H++2e- == NADH+H+  E0=-0.32∨

电池总反应:

  1/2 O2+NADH+H+ == H2O+HAD+

电势差ΔE0=+0.815-(-0.32)=+1.135V  正号表示放能

  即呼吸链的范围为1.135V

自由能变化:ΔG0=- n FΔE0   =-2 23.062 1.135

n-所传电子数  =-52.6Kcal/mol

F-法拉第卡当量: 23.062KcalV-1mol-1

同理计算  FADH2被O2氧化

  ΔG0=-42.4Kcal/mol

(二)电子传递和氧化呼吸链

在电子传递过程中,电子传递仅发生在相邻的传递体之间,可根据各种氢化一还原电对的E0值,判断电子流动方向,在酶催化下发生反应。

(1)电子传递链  电子从NADH到O2传递所经过的途径被称为电子传递链或呼吸链,主要由4部分蛋白质复合体组成,排列顺序为: (见P120  图24-2)

  黄素蛋白中的FADH2

  琥珀酸-Q

  还原酶

NADH→NADH-Q→Q→细胞色素→细胞色素C→细胞色素氧化酶→O2

  还原酶  还原酶

  电子传递酶复合体含一系列的电子载体和辅基为:

  黄素蛋白:  FMN,  FAD

  铁硫中心:  Fe-S复合体

  醌:  Q

  细胞色素:  血红素基因

  铜离子:  CuA  CuB

(2)电子传递链各个成员

1.  NADH-Q还原酶,简称复合体Ⅰ,又称NADH脱氢酶。辅基:FMN,Fe-S。

催化的反应为:

NADH+H++Q→NAD++QH2

反应分三步进行: 

⑴. NADH+H++FMN → FMNH2+NAD+

⑵. FMNH2+Fe-S(氧化型)→`FMN+Fe-S(还原型)

⑶. Fe-S(还原型)+Q`→`Fe-S(氧化型)+QH2

其中Fe-S中心有Fe-S,2Fe-2S和4Fe-4S三种类型,如P122  图 24-5所示。

在反应中发生3价Fe3+和2价Fe2+的价态变化。

2.  辅酶Q(CoQ):为易流动的疏水电子载体,与蛋白质结合不紧密,能自由在膜内扩散,

有氧化型(醌式)和还原型(酚)。结构式见P123  图 24-6。含有异戊二烯为单

位构成的长碳氢链,异戊二烯的数目n因动物而异,哺乳动物n=10记作Q10。

3.  琥珀酸-Q还原酶:又称复合体Ⅱ。该酶与柠檬酸循环中,催化琥珀酸脱氢生成延胡

索酸的琥珀酸脱氢酶构成完整的酶复合体,辅基 FAD, Fe-S。

催化的反应为:

FADH2+Q → FAD+QH2

使FADH2上高能电子进入电子传递链,此步无ATP生成。

反应分两步进行:

⑴. FADH2+Fe-S(+3) → FAD+Fe-S(+2)

⑵. Fe-S(+2)+QH2 → Fe-S(+3)+Q

4.  细胞色素还原酶:又称复合体Ⅲ。辅酶:血红素,Fe-S。

把电子和H+从一个QH2分子传递两个电子给2分子细胞色素C。

[细胞色素]:是一类含有血红素辅基的电子传递蛋白质的总称。因含血红素而显色,故称为细胞色素,几乎存在于所有生物体内。由吸收光谱不同而分为a、b、c三类。吸收峰位置见P124  表24-3。从吸收光谱知b又分为b566和b562,C又分为C和C1。

一个电子传递为:QH2 → 2Fe2S → C1 → C。

另一个电子为QH2 → 半醌 → b(b566-b562 →QH2。祥见P126  图24-10。

5.  细胞色素C:(Cyt c)

唯一能溶于水的细胞色素,由104个AA构成的单多肽链。

Cyt c和Co Q都是传递电子的流动载体,在接受细胞色素还原酶电子后立即传递给细胞色素氧化酶。

  6.细胞色素氧化酶:复合体Ⅳ。

把电子从Cyt c传递给氧

该酶有4个氧化-还原活性中心,含有两种细胞色素(Cyt a和Cyt a3)和两个铜离子(CuA和CuB)。

a和a3化学结构同,但处于酶的不同部位CuA和CuB由于结合的蛋白不同而有差异

电子传递顺序为:Cyt c → a – CuA → a3 – CuB → O2。

最后该酶传递4个电子到氧,形成2分子H2O。

7. 在氧化呼吸链中的NADH-Q还原酶、细胞色素还原酶和细胞色素氧化酶催化的三步反应中,自由能的变化都足以将H+从线粒体内膜基质“泵”出到线粒体的内外膜间隙,产生氢离子梯度,为产生ATP准备所需的自由能。

 (3) 电子传递的抑制剂

  为能够阻断呼吸链中某部位电子传递的物质,可用来研究电子传递顺序。原理见P128  图 24-15。

  常见的抑制剂有:

  1.  鱼藤酮,安密妥,结构见P128。

阻断NADH-Q还原酶内的电子由NADH向CoQ的传递。

2.  抗霉素A:抑制细胞色素还原酶中电子从QH2到Cyt c1的传递。

3.  氰化物,叠氮化物与a3中血红素Fe3+作用。CO与a3中Fe2+作用,均阻断电子在细胞色素氧化酶中传递作用。上述各种抑制剂的抑制部位可表示为NADH → NADH-Q还原酶

-║→  QH2  -║→ CytC1 → CytC → 细胞色素氧化酶  -║→ O2 

鱼藤酮,  抗霉素A  CN-,N3-,CO 

安密妥

(三)氧化磷酸化作用

  将生物氧化过程中释放的自由能用以使adp和无机磷酸生成高能ATP的作用都在细胞线粒体内膜发生作用。

  氧化磷酸化全过程方程式为:

  NADH+H++3ADP+3P1+1/2 O2 → NAD++4H2O+3ATP

 (1) P/O比:一对电子通过呼吸链传至氧所产生的ATP分子数。

  NADH的P/O比为2.5(过去为3),从呼吸链NADH-Q还原酶进入。

  FADH2的P/O比为1.5(过去为2),是从细胞色素还原酶处进入电子传递链。

 (2) ATP合成部位

  为三个能量释放部位。

  一对电子经NADH-Q还原酶,细胞色素还原酶和细胞色素氧化泵泵出质子数分别为4,2和4。合成一个ATP要3个质子通过ATP酶驱动合成2.5个ATP需7.5个质子驱动,合成1.5个ATP需4.5个质子驱动,多余的质子可能用于将ATP从基质运往膜外细液。

  ATP合成是在线粒体ATP酶作用下完成的,现称ATP合酶,又称复合体V。

 (3)能量偶联假说

 电子传递释放出的自由能和ATP合成是与一种跨线粒体内膜的质子梯度相偶联的,1961年提出,1978年获诺贝尔化学奖。:

  如P132  图 24-18所示:

  电子传递链为一个H+泵,使H+从线粒体基质排到内膜外;内膜外H+比内膜高,形成H+浓度梯度;电化学电势驱动H+通过ATP合酶F0F1ATP回到线粒体基质,释放自由能与ATP合成偶联

  此过程为:

1.质子泵出需要能量:由电子流过复合体Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ获得。

2.质子泵出使细胞溶胶侧H+浓度提高,产生膜电势。

3.膜电势驱动质子流通过ATP合酶,同时释放出与酶牢固结合的ATP,ATP是在释放自由能驱动力下ADP与Pi合成的。

F0F1-ATP酶:F0单为嵌入线粒体内膜中,为质子通道;F1在膜外为球状体。催化ATP的合成。

(四)氧化磷酸化的解偶联和抑制

  一般情况下,电子传递和磷酸化是紧密结合的,但特殊的试剂可将氧化磷酸化过程分解成单个的反应。

 (1)解偶联剂:

  只抑制ATP的形成过程,不抑制电子传递过程,使电子传递产生的自由能变成热能。如DNP(2,4-二硝基苯酚),当pH=7时,DNP呈酚负离子形式,不能透膜。在酸性环境(H+浓度提高),DNP接受质子而成酚分子形式,脂溶性而易透膜,将H+带入膜内,破坏了跨膜梯度的形成,故DNP又称质子载体。

  褐色脂肪细胞线粒体内膜上有特殊H+通道,H+流回不经过F0F1-ATP酶,不产生ATP产生热,维持体温。

(2)氧化磷酸化抑制剂:

  因抑制ATP形成而使电子传递停止,如寡霉素。但为寡霉素抑制的电子传递会由于加入DNP,使H+浓度差消除,而使电子传递恢复。如P138  图24-27

(3)离子载体抑制剂

  它们与K+等离子结合,作为离子载体穿过膜,消除膜电势,如短杆菌肽,缬氨霉素ATP不能生成。

第六章  脂质与生物膜  上册  p79 

6-1 引言

(1)脂质:一类低溶于水而溶于非极性溶剂的生物有机分子。结构差异极大。

(2)分类:

单纯脂质:如甘油三酯、蜡。

复合脂质:除含脂肪酸和醇外,还有非脂成分。

  1. 磷脂:  甘油磷脂,鞘磷脂。

  2. 糖脂:  非脂成分为糖。

  3. 衍生脂质:由1与2衍生而来。如脂肪酸,固醇类(胆酸、性激素、肾上腺皮质激素),萜,天然色素(胡罗卜素)。

  其他脂质:维生素A、D、E.,前列腺素,脂蛋白。

(3)脂质的生物学作用:

  1. 贮存脂质:能量主要贮存形式,如甘油三酯和蜡。1克油脂在体内完全氧化为1克糖或蛋白产生能量的2.2倍。

  2. 结构脂质:构成生物膜的骨架。

  3. 活性脂质:具专一的重要生物活性,如类固醇,维生素A、D、E、K,前列腺素,泛醌。

6-2  脂肪酸:

(一)结构特点:

(1)天然脂肪酸通常偶数碳原子,一般12-22个碳。

  (2)脂肪酸有饱和、单不饱和和多不饱和。不饱和双键一个处于C9-C10之间,且为顺式(cis),为反式必须加t(trans)。

  (3)多不饱和脂肪酸(PUFA):往往不共轭。

  P83  表2-2  某些天然存在的脂肪酸

  硬脂酸  n-十八酸  18:0

  油酸  十八碳-9-烯酸  18:1Δ9

  亚油酸  十八碳-9,12-二烯酸  18:2Δ9,12

  α-亚麻酸  十八碳-9,12,15-三烯酸  18:3Δ9,12,15

  γ-亚麻酸  十八碳-6,9,12-三烯酸  18:3Δ6,9,12

  EPA  二十碳-5,8,11,14,17-五烯酸  20:5Δ5,8,11,14,17

  DHA  二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酸  22:6Δ4,7,10,13,16,19

  反油酸  十八碳-9-烯酸(反)  18:1Δ9(t)

(二) 必需多不饱和脂肪酸:

  对人体的功能不可缺少,但必须由膳食提供的两个不饱和脂肪酸,如亚油酸和α-亚麻酸。

  亚油酸: 第一个双键离甲基末端6个碳,为ω-6系列。

  γ-亚麻酸:第一个双键离甲基末端3个碳,为ω-3系列。

  (三)类二十碳烷:20碳多不饱和脂肪酸至少含三个双键,包括几类信号分子:

(1)前列腺素(PG):有升高体温(发烧),促进炎症(产生疼痛)等一系列生理作用。

(2)凝血恶烷(TX):诱发血小板聚集,促进血栓形成。

(3)白三烯(LT):促进过敏反应,如发生哮喘,

阿司匹林(乙酰水杨酸),有关闭前列腺素PGH的合成,所以抗炎;抑制TX A2形成而抗血凝。

6-3  磷脂:两类,甘油磷脂和鞘磷脂。

(一)甘油磷脂的结构:

甘油的sn命名

(1)甘油结构用Fisher投影式表示,C2的-OH写在左边。

(2)三个碳原子顺序编号1.2.3(立体专一编号)

用sn写在化合物名称前面

(二)甘油磷脂一般性质:

(1)纯品为白色蜡状固体,溶于大多数含水非极性溶剂,难溶于无水丙酮。

  (2)属于两亲物质,可成膜。P81  图2-1画出脂质几种常见结构单分子层、双分子层、微团、微囊。

  (3)被磷脂酶专一水解。

  磷脂酶A1,A2,C,D作用甘油磷脂不同位置(P105),如磷脂酶A1,A2,分别专一除去sn-1位和sn-2位上的脂肪酸。

(三)常见的甘油磷脂(结构式见P104  图2-10及表2-5)

(1)磷脂酰胆碱(PC)

1,2-二酰基-sn-甘油-3-磷酰胆碱

又称卵磷脂,3-sn-磷脂酰胆碱,为细胞膜中最丰富的脂质。

头基胆碱,代谢中一种甲基供体,可归为B族维生素。

卵磷脂和胆碱可防止脂肪肝,一般从大豆油和蛋黄中提取。

  (2)磷脂酰乙醇胺(PE):

又称脑磷脂,头基为乙醇胺,又称胆胺。

为细胞膜中另一种最丰富的脂质。

  (3)磷脂酰丝氨酸(PS)

头基丝氨酸。分子净电荷-1,(PC、PE均为0)。

可引起损伤表面凝血酶活化。

PC,PE,PS之间在体内可互相转化。

  (4)磷脂酰肌醇(PI)

   PIP2磷脂酰肌醇-4,5-双磷酸,可将许多细胞外信号转化为细胞内信号。

  (5)磷脂酰甘油(PG)

头基为甘油,且常与Lys相连。

在细菌细胞膜中常见。

(四)醚甘油磷脂

甘油骨架sn-1位碳上是O-烃基(醚键相连)。

  (1)缩醛磷脂 (见P107)

sn-1位为含α,β不饱和醚(cis),头基可为胆碱,乙醇胺和Ser,脊椎动物心脏中富含缩醛磷脂。

  (2)血小板活化因子 (见P107)

sn-2位为乙酰基。

能引起血小板凝集和血管扩张,是炎症和过敏反应的有效介体。

(五)鞘磷脂  (SM)

  即鞘氨醇磷脂,在高等动物的脑髓鞘和红细胞膜中特别丰富。

  (1)鞘氨醇:已发现60多种,哺乳动物的鞘磷脂常见为D-鞘氨醇:反式-D-赤藓糖型-2-

  氨基-4-十八碳烯1.3-二醇,结构式见P107。

  其次为二氢鞘氨醇。

  (2)神经酰胺 (Cer)

  脂肪酸通过酰胺键与鞘氨醇的-NH2相连,结构上与二酰甘油相似,见P108。

  (3)鞘磷脂

  神经酰胺的1位伯羟基被磷酰胆碱等酯化,结构见P108。

6-4  糖脂

  为糖通过其半缩醛羟基以糖苷键与脂质连接的化合物,由脂质部分不同可分为鞘糖

  脂、甘油糖脂以及类固醇衍生的糖脂。

比较重要的有:

(1) 脑苷脂:为中性鞘糖脂,如半乳糖苷神经酰胺等,占脑干重的11%。结构见P109  图2-11。

  (2)神经节苷脂:为糖基部分含有唾液酸的酸性鞘糖脂,在神经系统特别是神经末梢中含量丰富。种类很多,在神经冲动传递中起重要作用。结构见P109。

6-5 类固醇

  又称甾类,结构以环戊烷多氢菲为基础,类固醇中一大类称为固醇或甾醇,其中最重要的为胆固醇。结构见P114  图 2-16。

  胆固醇除人体自身合成外,还可从食物中获得。

  胆固醇是脊椎动物细胞重要成分,在真核生物细胞脂膜中维持生物膜流动性和正常透过能力。

  胆固醇在神经组织和肾上腺中含量丰富,脑中固体物质的17%为胆固醇。

  7-脱氢胆固醇存在于动物皮下,在紫外线作用下形成维生素D3,见上册P437。

6-6  生物膜的组成和性质  上册P589  18上

细胞的外周膜(质膜)和内膜系统统称为生物膜。生物膜结构是细胞结构的基本形式。

生物膜主要由蛋白质(包括酶)、脂质(主要是磷脂)和糖类组成。生物膜的组分因膜的种类不同而不同,如P589(表18-1),一般功能复杂或多样的膜,蛋白质比例较大,蛋白质:脂质比例可从1:4到4:1。

(一)膜脂:有磷脂、胆固醇和糖脂。

(1)  磷脂:构成生物膜的基质,为生物膜主要成分。包括甘油磷脂和鞘磷脂,在生物膜中呈双分子排列,构成脂双层。

(2)  糖脂:大多为鞘氨醇衍生物,如半乳糖脑苷脂和神经节苷脂。

(3)  胆固醇:对生物膜中脂质的物理状态,流动性,渗透性有一定调节作用,是脊椎动物膜流动性的关键调节剂。

  膜分子的相变温度TC为膜的凝胶相和液晶相的相互转变温度。磷脂分子成膜后头基排列整齐,在TC以下时,尾链取反式构象(全交叉),排列整齐,为凝胶相;而在TC以上时,尾链成邻位交叉,形成“结”而变成流动态,为液晶相。见P597  图18-15。

  胆固醇的作用是:当t TC,胆固醇阻扰磷脂尾链中碳碳键旋转的分子异构化运动,阻止向液晶态转化,使相变温度提高;而当t TC时,胆固醇又阻止磷脂尾链的有序排列,阻止向凝胶态转化,降低相变温度。胆固醇总的作用是使相变温度变宽,保持膜的流动性。

(4) 膜脂的多态性:

  膜脂是两亲分子,具有表面活性剂分子在水中的多态性和性质。

  在水-空气界面上形成单分子层。

  浓度超过一定数值后,磷脂分子就以微团(micelles)或双层(bilayer)形式存在,脂双层进一步自我组成闭合的脂质体(liposomes),P592  图18-6。另外脂双层还有六角形相排列,P592  图18-7,P593  图18-8。

(二)膜蛋白:承担由膜实现的极大多数膜过程。

由在膜上定位分为:

外周蛋白:分布在膜的脂双层表面。

内在蛋白:或部分埋在脂双层疏水区或跨全膜。

外周蛋白一般溶于水,易于分离;内在蛋白不溶于水,难于分离,因此已确定结构的不多。

脂质为膜蛋白提供合适的环境,往往是膜蛋白表现功能所必需的。

(三)糖类:约占质膜重量的2~10%,大多数与膜蛋白结合,少量与膜脂结合,分布于质膜表面的多糖-蛋白复合物中,常称细胞外壳,在接受外界信息及细胞间相互识别方面具有重要作用。

6-7  生物膜的分子结构

生物膜是蛋白质、脂质和糖类组成的超分子体系,彼此之间是有联系有作用的。

(一)生物膜分子间作用力:静电力,疏水力和范德华引力。

(二)生物膜结构的主要特征:

(1)膜组分的不对称分布:各组分在膜两侧分布是不对称的,从而导致膜两侧电荷数量、流动性等的差异,与膜蛋白定向分布及功能密切相关。

  (2)生物膜的流动性:合适的流动性对生物膜表现其正常功能具有十分重要的作用。生理条件下,磷脂大多呈液晶态,各种膜脂由于组分不同而具有各自的相变温度。

  膜的流动性主要取决于:

1.  脂肪酸的链长和不饱和度

链长:磷脂中的脂肪酸长度越长,相互作用越强越易排列,链长要适中。

不饱和度:双键越多,越不易排列。顺式双键在烃链中产生弯曲,出现一个“结”,使TC下降。

细菌中脂肪酸侧链如甲基、环丙基等,作用与双键同。

原核生物通过脂肪酸链的双键、侧链和链长度来调节膜的流动性。

E.coli  420C时,饱和和不饱和脂肪酸之比为1.6:1,而27OC时则为1:1。不饱和比率增加,可防止膜在低温下变得过于刚硬。

2.  胆固醇:为真核生物膜流动的关键调节剂。

3.  其他:膜蛋白、鞘磷脂含量,温度、pH、离子强度,金属离子等都对膜流动性有影响。

许多疾病患者的病变细胞膜流动异常。

(三)膜分子的运动:

(1)脂类和许多膜蛋白分子都不断进行侧向扩散或侧向移动,脂类在膜平面中扩散很快,而膜蛋白只几个μm/min。

(2)在脂双层中从双层一侧转到另一侧的翻转,磷脂分子困难,膜蛋白则不能翻转。

(3)烃链围绕C-C键旋转而导致异构化运动和凝胶相与液晶相互变。

(4)还有围绕膜平面相垂直的轴左右摆动及旋转运动。

(四)生物膜的流体镶嵌模型:

是已获比较广泛支持的生物膜分子结构模型。见P600  图18-21。

6-7  生物膜的物质运送  下册 P46

(一)生物膜的主要功能为:

(1)分隔细胞、细胞器,细胞及细胞器功能的专门化与分隔密切相关。

  (2) 物质运送:生物膜具有高度选择性的半透性阻障作用,膜上含有专一性的分子泵和门,使物质进行跨膜运送,从而主动从环境摄取所需营养物质,同时排除代谢产物和废物,保持细胞动态恒定。

 (3)能量转换:如氧化磷酸化和光合作用均在膜上进行,为有序反应。

 (4)信息的识别和传递:在生物通讯中起中心作用,细胞识别、细胞免疫、细胞通讯都是在膜上进行的。

(二)生物膜的主动运送和被动运送:

  有些细胞有很高的浓缩功能,如海带收集碘。

根据物质运输自由能变化,可分为被动运输和主动运输。

 (1)被动运输:物质从高浓度一侧顺浓度梯度的方向,通过膜运输到低浓度一侧的过程。

 (2)主动运输:物质逆电化学梯度的运输过程,它需要外界供给能量方能进行。

  主动运输具有专一性、饱和性、方向性、选择性抑制和需提供能量等特点。

(三)小分子物质的运输:

根据运输物质分子的大小,物质运输又分为小分子运输与生物大分子运输。

由于膜脂双层疏水区,疏水小分子、N2、苯等易通过膜,不带电荷的小极性分子,如甘油、脲、CO2也可通过。见P48  图21-2。

Na+,K+,Ca2+,Cl- 等离子跨膜运送大多是通过专一性蛋白运送。

(1)Na+,K+,泵:

  细胞内都是高K+低Na+,细胞外为高Na+低K+,这是由称为钠钾泵的蛋白主动运送的结果。

 (2)Na+,K+-ATP酶通过水解ATP提供的能量主动向外运输Na+而向内运输K+。

  每分解一个ATP分子泵出3个Na+,泵入2个K+,见P49  图21-4。

 (3)Na+,K+-ATP酶作用机制──构象变化假说。P50  图  21-6。

1.  Na+与ATP酶结合。

2.  细胞质侧ATP酶被ATP磷酸化,消耗1分子ATP。磷酸基团转移到ATP酶上。

3.  诱导ATP酶构象变化,将Na+运送至细胞膜外侧。

4.  K+结合到细胞表面。

5.  ATP酶去磷酸化。

6.  ATP酶回到原来构象,K+通过膜释放到细胞质侧。

 (4)生理意义:不仅维持细胞的膜电位,成为可兴奋细胞,是神经、肌细胞等的活动基础,可调节细胞的体积和驱动某些细胞中糖和氨基酸的运送。

(四)生物大分子的跨膜运输:

  多核苷酸或多糖等生物大分子甚至颗粒物的运输主要是通过胞吐作用、胞吞作用,P56  图21-4。

(1)胞吐作用:细胞内物质先被囊泡裹入形成分泌泡,然后与细胞质膜接触,融合并向外释放被裹入的物质。

 (2)胞吞作用:细胞从外界摄入的大分子或颗粒逐渐被质膜的一小部分包围,内陷,然后从质膜上脱落,形成含有摄入物质的细胞内囊泡。

  胞吞与胞吐过程相反。

6-8  人工模拟膜

用不含蛋白质的磷脂和表面活性剂制备功能胞囊膜,模拟生物膜的多种功能。

(一)模拟生物膜功能:

 (1)模拟物质的运送和调控,用于分离、提取和浓缩所需物质,如污水处理,海水浓缩所需物质,海水淡化。

 (2)靶向给药和可控缓释给药:

用脂质体对药物和疫苗进行包结,在体内可控释放、延长和增强药效。

包结药品的脂质体表面连接上抗体,可实现靶向给药,抗体在体内寻找抗原,结合后药物定点释放。

 (3)模拟膜上的化学反应:

  利用膜分子排列有序,使反应按一定方向有序进行,膜提供的微环境如有机溶剂,可加速反应进行,为一些酶促反应提供场所。

 (4)生物传感器:

  模拟叶绿素体膜、类囊体膜,将太阳能转化成电能或化学能,模拟视觉和嗅觉。

 (5)制备纳米材料:

  用超声法制备单层小泡囊(体积20~50nm)包结制备纳米材料。

(二)表面活性剂分子在水中:

  一般一条疏水链的表面活性剂,如硬脂酸纳在水中形成胶束,具有两条疏水链的亲水亲油分子,如磷脂在水中形成双层泡囊──脂质体,人工合成的二烷基四级铵盐(体内不存在的两亲化合物),形成双层泡囊,常用于人工模拟膜的制备。

(四)模型膜的主要类型:

 (1)LB膜(Langmuir-Blodgett):

最适宜研究两亲分子的排列和取向和脂质分子微小结构变化。

1.  Langmuir膜(单层膜):借助膜天平可测表面压──面积等温图,可测膜分子成膜后的截面积,了解两亲分子构造,排列和取向。

2.  LB膜:单分子层膜累积而成的多分子层膜称为LB膜。

  由于LB膜具有规则的排列和取向,高度各向异性,超薄(几个nm)均匀,厚度可控制,可在分子水平上任意组装,将功能分子引入可成为分子器件,因此具有广阔应用前景和巨大科学价值。

 (2)BLM(双层膜):

可研究膜电容、厚度和电阻,可用于透过膜的传输过程的研究。

 (3)脂质体(Liposomes):

单层小泡囊  SUV  大小:200~500Å

单层大泡囊  LUV  1000~105Å

多层大泡囊  MLV  1000~8000Å

脂质体与细胞膜相似,适合于大量的生物物理和生物化学研究,如测量膜的渗透性,研究活性膜蛋白的重组。

已用于表面识别反应:药物载体,靶向给药;酸性药物的去除;人工肾(包结脲酶);物质分离;液膜反应器等。

   第七章  核酸 

7-1  核酸通论: 上册 P470  12上

蛋白质的合成取决于核酸,生物功能由蛋白质来实现。核酸保证了生命精确复制自己,生命信息是通过核酸来储存、传递和表达的。

(一)核酸的发现和研究简史:

(1)核酸的发现

  1868年从外科绷带上脓细胞发现含DNA的脱氧核糖核蛋白。

  (2)DNA双螺旋结构模型的建立

  1953年Watson和Crick提出DNA双螺旋结构模型,为分子生物学发展奠定了基础,为20世纪自然科学中最伟大的成就之一。

  (3)生物技术的兴起

1.  DNA重组技术:将外源DNA片断插入质粒DNA或病毒DNA分子内,获体外重组体,并克隆。

2.  基因工程:将DNA重组技术用于改变生物机体的性状特征,改造基因以至改造物种统称为基因工程。

3.  核酶(ribozyme):RNA在自我拼接切除过程中具催化功能。

4.  反义RNA:是与mRNA互补的RNA分子与mRNA结合后,可阻断mRNA的翻译,是在翻译水平调控基因表达的一种方式。

5.  同源异形体蛋白质:一个基因转录产物通过选择性拼接可形成多种同源异形体蛋白质,不是一个基因一条多肽链。

6.  基因芯片:将大量与人类疾病等相关的基因高密度排在只有指甲盖大小的玻璃片或纤维膜上。用血液或其他体液滴在芯片上,进行检测和诊断。可进行疾病诊断、药物筛选、基因功能研究、生物制剂检测、检疫、司法鉴定等。

7.  克隆:将编有密码的目标蛋白质基因导入宿主细胞进行转录和翻译,制造蛋白或产生新个体。

转基因后再克隆,已导致一个新的生物技术产业群的兴起。

克隆羊等克隆动物的诞生:将体细胞在细胞分化过程中被关闭的基因启动,向干细胞过渡,通过电脉冲等方法融合到去核的卵细胞中,再在动物子宫中发育成个体。

  (4)人类基因组计划(HGP)

  1990年正式开始,2000年6月完成“工作框架图”,人类有32亿(3.2×10 9)个碱基对,3万多个结构基因。

  生命科学进入后基因组时代:研究从揭示基因组DNA序列转移到在整体水平上对基因组功能的研究,产生功能基因组学新学科。

  人类基因组中编码蛋白质基因总数超过3万,能够产生蛋白质的数目是基因数的10倍。

(二)核酸(DNA和RNA)的种类和分布

(1) DNA(脱氧核糖核酸):主要遗传物质,通过复制而将遗传信息由亲代传给子代,DNA通常是双链分子。

(2) RNA(核糖核酸):有三类,转移RNA(tRNA),核糖体RNA (rRNA),信使RNA(mRNA)细胞RNA通常都是线型单链分子。

(三)核酸的生物功能

(1)  DNA是主要遗传物质:Avery细菌转化实验,从光滑型肺炎球菌(菌落光滑的Ⅲ型肺炎球菌)细胞中提取纯化的DNA、蛋白质及多糖,分别加到无荚膜、菌落粗糙的Ⅱ型细菌培养物中,结果发现只有DNA能使一部分Ⅱ型细菌细胞获得合成菌落光滑的Ⅲ型细胞特有的荚膜多糖的能力,蛋白质及多糖没有这种转化能力。已转化了的细菌,其后代仍保留合成Ⅲ型光滑荚膜的能力。P475  图12-1 肺炎球菌转化作用图解。

(2)  RNA参与蛋白质生物合成:

rRNA起装配和催化作用,tRNA携带氨基酸并识别密码子,mRNA携带DNA的遗传信息并作为蛋白质合成的模板。

(3)  RNA功能多样性:

核心功能是遗传信息由DNA到蛋白质的中间传递体,基因表达的信息加工和调节,均关系到生物机体的生长和发育。

7-2 核酸的结构  P478

  核酸的基本结构单位是核苷酸,核苷酸由核苷和磷酸组成,核苷由戊糖和碱基组成。

  碱基:在RNA中为腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶等四种;在DNA中,为腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶(代替尿嘧啶),也是四种。

(一)核苷酸:

  由所含戊糖不同分为(核糖)核苷酸和脱氧(核糖)核苷酸,所含戊糖分别为D-核糖和D-2-脱氧核糖。

(1)  碱基:携带遗传信息,5种基本碱基化学组成,见 P478 表13-1,结构式见 P479。 

1.  嘧啶碱:

胞嘧啶  2-氧-4-氨基嘧啶  Cyt  C

尿嘧啶  2,4-二氧嘧啶  Ura  U

胸腺嘧啶  5-甲基尿嘧啶  Thy  T

2.  嘌呤碱:

腺嘌呤  6-氨基嘌呤   Ade  A

鸟嘌呤  2-氨基-6-氧嘌呤  Gua  G

3.  稀有碱基:

  除以上5种基本碱基外,核酸中还有的一些含量甚少的碱基,大多数为甲基化碱基,tRNA中含有较多的稀有碱基,可高达10%。

  P479 表13-2为核酸中一部分稀有碱基的名称,注意缩写:

  hm5 U  5-羟甲基尿嘧啶

  m5 C  5-甲基胞嘧啶

  DH U  5,6-二氢尿嘧啶

  mo5 U  5-甲氧基尿嘧啶

  m26 U  N6,N 6-二甲基腺嘌呤

  次黄嘌呤  6-氧嘌呤  Ⅰ

(2)  核苷:由核糖和碱基组成,糖环上编号右上角加一撇。糖与碱基间连键是N-C键,为β-糖苷键。 碱基与糖环平面互相垂直。

结构式见 P480,如 腺嘌呤核苷  A  胞嘧啶脱氧核苷  dc

另外还有C-C糖苷键的核苷,如假尿嘧啶核苷 Ψ, 结构式见 P481, 为尿嘧啶C5与核糖1'-位碳相连。此外在tRNA中还含有碱基不是嘌呤环,而为鸟嘌呤衍生物的W(Y)和Q核苷,见P481。

常见的核苷  P480 表13-3

核(糖核)苷

腺(嘌呤核)苷  adenosine  A

鸟(嘌呤核)苷  guanosine  G

胞(嘧啶核)苷  Cytidine  C

尿(嘧啶核)苷  Uridine  U

脱氧核(糖核)苷

  脱氧腺苷  deoxyadenosine  dA

  脱氧鸟苷  deoxyguanosine  dG

  脱氧胞苷  deoxycytidine  dC

  脱氧胸苷  deoxythymidine  dT

(3)核苷酸:核苷的磷酸酯:

  核糖核苷糖环上有3个自由羟基,可生成三种核苷酸。

脱氧核糖糖环上有2个自由羟基,可生成二种核苷酸。

生物体内游离存在多为5'-核苷酸。

常见核苷酸见 P481 表13-4,为核糖-5'-一磷酸。

AMP  GMP  CMP  UMP  dAMP  dGMP  dTMP  dCMP

若为核苷-3'-磷酸或-2'磷酸,应标出3'或2',如3'-AMP,2'-AMP。

核糖-5'-二磷酸:如ADP,核糖-5'-三磷酸:如ATP。

环核苷酸一般为3',5'-环化,如c-AMP。

(二)核酸的共价结构

(1)核酸中核苷的连接方式:  P482

  核酸中核苷酸以3',5'-磷酸二酯键彼此相连,走向为3'→5'。简写时从5'→3',从左到右书写:

  如  pACTG  pG表示p在5'位,Gp表示p在3'位

  5'   3’

  因此ACTG与GTCA不一样,一个5'端为A,A上有游离的5'-OH,一个5'端为G,G上有游离的5'-OH。

(2)  DNA一级结构:

DNA中D-核糖没有2'-OH,所以只能形成3',5'-磷酸二酯键,DNA无支链。

P483 图13-2表示DNA多核苷酸的一个小片段及竖线式缩写和文字式缩写。

DNA相对分子量非常大,分子量可超过108bp(碱基对),可编码信息量十分巨大。为阐明生物的遗传信息,首先要测定生物基因组的序列。

原核生物基因序列是连续的,常组成操纵子,很少重复序列;真核生物基因序列是断裂的, 有内含子,不组成操纵子,含有较高比例的重复序列,调控序列比占比例大。人类基因组大小为32亿碱基对,真正用于编码蛋白质的序列仅占基因组的1.1%到1.4%,编码蛋白质基因大约为3.1万个。

(3)  RNA一级结构:

虽有2'-OH,但仍为无分支线型多聚核糖核苷酸,组成RNA核苷酸仍为3',5'-磷酸二酯键彼此连接。

1.  tRNA:通常由73~93个核苷酸组成,沉降系数45。3'端为CpCpAOH,5'端多为pG,也有为pC的。

2.  rRNA:含有较多甲基化的核糖。细菌的rRNA有5S、16S和23S三种,哺乳动物rRNA有5S、5.8S、16S和28S四种。rRNA除作为核糖体骨架外,还分别与mRNA和tRNA作用,催化肽键的形成,促使蛋白质合成的正确进行。

3.  mRNA: 原核生物一条mRNA链上有多个编码区,5'端和3'端各有一段非翻译区;真核生物mRNA一级结构通式如P484 图13-4所示,5'端有帽子,Ⅰ型帽子结构见P485,可记作m7G5’ppp5’NmpNp,(m在字母左,表示碱基被甲基化,右上角数字表示甲基化位置,m在字母右侧表示核糖被甲基化,G-鸟苷,N为任意核苷,p磷酸)。这种结构有抗5'-核酸外切酶的降解作用,并有助于核糖体对mRNA的识别和结合,使翻译得以正确开始。3'端大多有一尾巴,为20~250个A的聚腺苷酸poly(A),与mRNA的半寿期有关。

(三)DNA的高级结构:

(1)  1953年Watson与Crick提出的DNA双螺旋结构模型,主要有三方面依据:

1.  核酸化学结构和核苷酸键长和键角数据。

2.  DNA  X-射线衍射分析。

3.  DNA碱基组成的Chargaff规则;同一物种不同组织和器官,DNA碱基组成  具有生物种特异性。且摩尔数为A=T, G=C, A+C=G+T。

(2)  DNA二级结构:

W-C DNA分子双螺旋结构模型见P480 图13-5,要点如下:

1.  两条反向平向的多核苷酸链围绕同一中心轴相互缠绕,两条链均为右手螺旋。

2.  碱基位于双螺旋内侧,核酸与核糖在外侧,彼此通过3',5'-磷酸二酯键相连接,形成DNA分子骨架。碱基平面与纵轴重直,糖环平面与纵轴平行。多核苷酸链方向3'→5'为正向(P487 图13-6),形成一条大沟和一条小沟。

3.  双螺旋平均直径为2nm,两个相邻碱基对之间相距高度为0.34nm,两核苷酸之间夹角为360,沿中心轴每旋转一周有10个核苷酸,每一转的高度(螺距)为3.4nm。

4.  两条链被碱基之间形成的氢键连成一体,互相匹配,A与T配对,形成两个氢键,G与C配对,形成三个氢键。

5.  碱基在一条链上的排列顺序不受任何限制,一条链序列确定后则决定另一条互补链序列。遗传信息由碱基序列所携带。

DNA结构可受环境影响而改变,有A、B、C、D、E和Z型等不同构象存在。

1.  B型是DNA基本构象,E型为左手双螺旋。

  B型:为W-C双螺旋结构,DNA钠盐在较高湿度下(92%)制得的纤维结构。

  A型:螺体较宽而短,RNA分子双螺旋区以及RNA-DNA杂交双链具有与A-DNA相似结构。

  P489 表13-6  A、B和Z型DNA的比较。

  DNA二级结构主要是形成双螺旋,但在某些情况下也能形成三股螺旋,第三股的碱基可与W-C碱基对中嘌呤碱形成配对。P489 图13-10三股螺旋DNA碱基配对。

  H-DNA是通过分子内折叠形成的三股螺旋(P490 图13-11 H-DNA结构),它存在于基因调控区,因而有重要生物学意义。

(3)  DNA三级结构:

DNA三级结构指DNA分子(双螺旋),通过扭曲和折叠形成的特定构象,包括不同二级结构单元间的相互作用,单链与二级结构单元间的相互作用以及DNA的拓扑特征。

超螺旋是DNA三级结构的一种形式,是双螺旋的螺旋。

将环状DNA分子再额外多转几圈或少转几圈,都会使双螺旋中存在张力,为抵消张力,环状DNA分子的轴再曲绕而形成超螺旋,左旋为负,右旋为正。

DAN分子十分巨大,要组装到有限的空间,压缩比达1000-2000,组装成染色体则高达8000-10000(p492表13-7)。为此绝大多数DNA以超螺旋形式存在,把很长的DNA压缩成很小的体积内。如人类第一号染色体DNA长7.2cm,经弯曲缠绕后只有近10μm(压缩约7700倍)。

由于DNA双螺旋为右旋,负超螺旋(左旋)有利于双螺旋解旋,自然界存在的环状DNA几乎全是负超螺旋。

DNA复制、重组或转录时,必须解旋解链,暴露出DNA结合位点,使各种调控蛋白发挥作用,随后再形成超螺旋,存在拓扑学问题。生物过程需负超螺旋程度不同,可通过DNA拓扑异构来调节其功能。

环状DNA的一些重要拓扑学性质:

(拓扑学是数学的一个分支,研究物体变形后仍保留下的结构特性。)

1.  连环数L:

为一条链以右手螺旋绕另一条链缠绕次数,为一个整数。

L值不同,则为拓扑异构。

2.  扭转数T:

指DNA分子中的Watson-Crick螺旋数。天然DNAT变化不大,变化时有张力。

3.  超螺旋数W:

为超螺旋的超绕数,右旋为正,左旋为负。

L、T、W三者关系:

L=T+W  L为整数,T、W可带小数。

4.  比连环差λ:

表示超螺旋程度

λ=L-L0/L0  L0为松弛环形DNA(无超螺旋)的L值。

P491 图13-12 环状DNA不同构象:

A:线型DNA。

B:环状DNA,松弛型DNA,L=25,T=25,W=0。

C:解链环状:拧松两周后,可形成两种环状DNA,一种即为解链环状L=23,T=23,W=0  有张力;另一种为超螺旋DNA,为D。

D:负超螺旋:形成超螺旋(左旋)消除解链影响,在力能学上有利,为自发过程,L=23,T=25,W=-2。

DNA拓扑异构:除连环数不同外(如上述L=25,L=23),其他性质均相同的DNA分子。

双螺旋DNA在拓扑异构变化中T相同,是W不同导致L不同。

DNA拓扑异构现象:为DNA超螺旋状态与解旋状态之间的相互转换,不发生碱基组成或顺序(一级结构)的任何变化,是DNA复制、重组或转录时所必需的。

拓扑异构酶:引起DNA拓扑异构之间转变的酶,可改变DNA拓扑异构体的L值,有两类:

Ⅰ类:使双链超螺旋DNA转变成松弛型环状DNA,每一次催化作用可消除一个负超螺旋,L值增加1。

Ⅱ类:使松弛型环状DNA转变成负超螺旋型DNA,每次催化作用使L减少2,又称促旋酶。

两类酶含量严格控制,使细胞内DNA保持一定超螺旋水平。

(4)  DNA与蛋白质复合物的结构(四级结构)

病毒、细菌拟核和真核生物的染色体都存在DNA的组装和一定程度的压缩。核小体是真生物染色质的基本结构单位,由核小体链形成纤维,进而折叠螺旋化,组装成不同层次结构的染色质和染色体。

病毒:通常只有几个至几十个基因,主要由核酸和蛋白质组成,有时还含有脂质和糖类。病毒的侵染性由核酸决定。核酸位于内部,蛋白质包裹着核酸为衣壳,有的还有脂蛋白被膜。

由宿主不同,病毒分为噬菌体(宿主细菌与放线菌),植物病毒和动物病毒。动物病毒含DNA或含RNA,有的还有被膜,如流感病毒(冠状病毒),表面有许多突起,见P494图13-14,流感病毒为RNA病毒。

(四)RNA的高级结构:

RNA通常是单链线型分子,但可自身回折形成局部双螺旋(二级结构),进而折叠(三级结构),除tRNA外,几乎细胞中的RNA都与蛋白质形成核蛋白复合物(四级结构)。RNA病毒是具有感染性的RNA复合物。

(1)  tRNA的高级结构:

二级结构都是呈三叶草形,P496 图13-18,双螺旋区构成叶柄,另外有几个突环区。

1.  氨基酸臂:3'-末端CCA,可接受活化的氨基酸。

2.  二氢尿嘧啶环:有两个DHU。

3.  反密码环:环中部为反密码子,由3个碱基组成,次黄嘌呤核苷酸常出现于反密码子中,反密码子可识别mRNA的密码子。

4.  额外环:是tRNA分类重要指标。

5.  TψC环:几乎所有tRNA在此环中都含有TψC,tRNA折叠形成三级结构,呈倒L型。

(2)  rRNA的高级结构:

核糖体是蛋白质合成的工厂,核糖体是一种核酶,催化肽键合成的是rRNA。

所有生物核糖体都是有大小不同两个亚基组成,大小亚基分别由几种rRNA和数十种蛋白质组成,见P498 表13-9。

7-3  核酸的物理化学性质  上册P502   14上

(一)核酸的水解:

所有糖苷键和磷酸酯键都能被水解。

(1)  酸水解:

糖苷键比磷酸二酯键易被水解,嘌呤碱糖苷键比嘧啶碱更易水解。

(2)  碱水解:

磷酸酯键易水解,RNA比DNA易水解,因为RNA核糖上有2'-OH,水解过程见P502。

(3)  酶水解:

为水解磷酸二酯键的酶,专一水解核酸的为核酸酶。

1.  核酸酶的分类:

按底物专一性分为RNase(核糖核酸酶)和DNase(脱氧核糖核酸酶)。

按对底物作用方式分为内切酶(作用点在核糖核酸酶内部)和外切酶(作用点在末端)。

2.  RNase:如牛胰核糖核酸酶(EC 2.7.7.16),内切酶,作用位点为嘧啶核苷(Py)-3'-磷酸与其他核苷酸之间的连键。

3.  限制性内切酶:为DNase。

剪裁DNA的工具,可用于核酸测序和基因工程。

在细菌中发现,目前已找到限制性内切酶数千种。限制性内切酶往往与甲基化酶成对存在,自身酶作用位点的碱基被甲基化,内切酶不再降解,因而可识别和降解外源DNA。

断裂位点处常有二重旋转(轴)对称性(回文结构,正读反读相同),在特定位点两条链切断后形成粘末端或平末端。

限制性内切酶命名:如E. coR Ⅰ,第1个字母E(大写),为大肠杆菌(E.coli)属名的第一个字母,第2、3两个字母co(小写)为种名头两个字母,第4个字母 R,表示菌株,最后一个罗马字为该细菌中已分离这一类酶的编号。

(二)核酸的酸碱性质:

核苷和核苷酸都是兼性离子,碱基和磷酸基均能解离,见P505,具有酸碱性。

由于DNA酸碱变性,使酸碱滴定曲线不可逆。

(三)核酸的紫外吸收:

嘌呤环与嘧啶环具有共轭双键,核苷和核酸的吸收波段在240~290nm,最大吸收值在260nm附近(蛋白质最大吸收值280nm)。

(1)  可用于测样品纯度(测吸光度A):

A260/A280比值,纯DNA应大于1.8,纯RNA应达到2.0,若样品混有杂蛋白,比值明显降低。

对于纯样品,从260nm的A值即可算出含量。A值为1,相当于50μg/mL  DNA双螺旋,或40μg/mL单链DNA(或RNA),或20μg/mL寡核苷酸。

(2)  核酸的摩尔磷吸光系数ε(P):为含有1克原子磷(30.98g)的核酸在260nm处的吸光系数。

  ε(P)=  A / CL. = 30.98 A / W L 

A:吸收值,  C:每升溶液的磷摩尔数,C=W/30.98,  L:比色杯内径。

一般天然DNA  ε(P)为6600,RNA为7700~7800

由于双螺旋结构使碱基对的π电子云发生重叠,使紫外吸收比单链减少,由此可判断DNA是否变性。

DNA变性时ε(P)值升高,增色效应。

DNA复性时ε(P)值降低,减色效应。

核酸比所含核苷酸单体的ε(P)低40~45%。

(四)核酸的变性、复性及杂交:

(1)  变性:核酸双螺旋区的氢键断裂变成单链,不涉及共价键的断裂。

降解:多核苷酸骨架上共价键(3',5'-磷酸二酯键)断裂,分子量降低。

引起变性因素:热变性,酸碱变性,变性剂(如尿素,甲醛等)变性(竞争形成氢键)。

DNA变性温度:又称熔点或熔解温度,为DNA双螺旋结构失去一半时的温度,用Tm表示,DNA的Tm一般为82~950C。DNA变性是爆发式的,变性在一个很窄温度范围内发生。

P508 图14-4为DNA变性过程。

影响Tm的因素:

1.  DNA的均一性:均一则Tm窄,如poly (A-T),  poly d(G-C)等, Tm窄。

2.  G-C含量:Tm值与G-C含量成正比,G-C含量越高,Tm值越高,因为G-C间三个氢键。

G-C含量与Tm关系的经验公式:

G-C% = (Tm  - 69.3) ×2.44

可由G-C含量计算Tm或由Tm计算G-C含量。

3. 介质离子强度:

离子强度较高时,DNA的Tm值较高,DNA较稳定,因此DNA的保存在含盐(如1mol NaCl)缓冲溶液中。

RNA的变性:RNA分子中有局部双螺旋区,所以也可发生变性,只是Tm值较低,且范围较宽

双链RNA变性几乎与DNA同。

(2)  复性:变性DNA在适当条件下,两条彼此分开的链重新缔合成双螺旋结构的过程称为复性。

变性DNA在缓慢冷却时,可以复性的过程称为退火。加热变性的DNA为防止复性,需骤冷处理。

DNA复性,浓度越大复性越快,且具有多重复序列的复性快。

(3)  核酸的杂交:不同来源的DNA热变性后慢慢冷却,若异源DNA之间某些区域有相同序列,则复性时会形成杂交DNA分子。

DNA与互补的RNA之间也可发生杂交。

核酸杂交应用广泛,可用来检测特殊核苷酸序列的一个或更多的DNA片断,将少量基因钓出,是基因芯片,基因探针的工作根据。

  第八章  核酸的降解和核苷酸的代谢  下册  P387

8-1  核酸和核苷酸的分解代谢  33下

  核酸在核酸酶(磷酸二酯酶)作用下降解成核苷酸,核苷酸在核苷酸酶(磷酸单酯酶)作用下分解成核苷与磷酸,然后再在核苷磷酸化酶作用下可逆生成碱基(嘌呤和嘧啶)和戊糖-1-磷酸。

(一)嘌呤碱的分解代谢:  P390  图33-2

首先在各种脱氨酶作用下水解脱去氨基(脱氨也可以在核苷或核苷酸的水平上进行),腺嘌呤脱氨生成次黄嘌呤(I),鸟嘌呤脱氨生成黄嘌呤(X),I和X在黄嘌呤氧化酶作用下氧化生成尿酸。人和猿及鸟类等为排尿酸动物,以尿酸作为嘌呤碱代谢最终产物;其他生物还能进一步分解尿酸形成尿囊素、尿囊酸、尿素及氨等不同代谢产物。

尿酸过多是痛风病起因,病人血尿酸 7mg %,为嘌呤代谢紊乱引起的疾病。可服用别嘌呤醇,结构见 P389,与次黄嘌呤相似。别嘌呤醇在体内先被黄嘌呤氧化酶氧化成别黄嘌呤,别黄嘌呤与酶活性中心的Mo(Ⅳ)牢固结合,使Mo(Ⅳ)不易转变成Mo(Ⅵ),黄嘌呤氧化酶失活,使I和X不能生成尿酸,血尿酸含量下降。

(二)嘧啶碱的分解代谢:  见P391  图33-3

  C:胞嘧啶先脱氨成尿嘧啶U,U再还原成二氢尿嘧啶后水解成β-丙氨酸。

T:胸腺嘧啶还原成二氢胸腺嘧啶后水解成β-氨基异丁酸。

8-2  核苷酸的生物合成

(一)核糖核苷酸的生物合成

(1)  从头合成:从一些简单的非碱基前体物质合成核苷酸。

1.  嘌呤核苷酸:从5-磷酸核糖焦磷酸(5-PRPP)开始在一系列酶催化下先合成五元环,后合成六元环,共十步生成次黄嘌呤核苷酸。然后再生成A、G等嘌呤核苷酸。

2.  嘧啶核苷酸:先合成嘧啶环(乳清酸),再与5-PRPP(含核糖、磷酸部分)反应生成乳清苷酸,失羧生成尿嘧啶核苷酸(UMP),再转变成其他嘧啶核苷酸。

(2)  补救途径:利用已有的碱基、核苷合成核苷酸,更经济,可利用已有成分。特别在从头合成受阻时(遗传缺陷或药物中毒)更为重要。

外源或降解产生的碱基和核苷可通过补救途径被生物体重新利用。

总之,无论动物、植物或微生物通常都能合成各种嘌呤和嘧啶核苷酸,满足自身需要。

(二)嘌呤核苷酸的合成

(1)  次黄嘌呤核苷酸的合成:用同位素标记的化合物实验证明,生物体内能利用CO2、甲酸盐、Gln、Asp和Gly作为合成嘌呤环的前体,见P391 图 33-4  嘌呤环的元素来源。

次黄嘌呤合成分成两个阶段,见P394 图 33-5。

第一阶段关五元环:5-PRPP与 ①Gln  ②Gly  ③N10-甲酰THFA  ④Gln  ⑤关环,生成5-氨基咪唑核苷酸。

第二阶段关六元环:5-氨基咪唑核苷酸与 ⑥CO2 ⑦Asp ⑧失去延胡索酸  ⑨N10-甲酰THFA  ⑩失水关环 ,生成次黄嘌呤核苷酸(IMP)。

(2)  嘌呤核苷酸的合成(P394):IMP与Asp反应(由GTP供能),再失去延胡索酸而成为AMP。

(3)  鸟嘌呤核苷酸的合成(P395):IMP被NAD+ 氧化生成黄嘌呤核苷酸(XMP)再与Gln反应(由ATP供能),氨基化生成GMP。

(4)  抗癌杀菌剂:

从嘌呤核苷酸生物合成得知:Asp、Gln和N10-甲酰THFA为合成原料,因此这些化合物的结构类似物可成为酶的抑制剂,抑制嘌呤核苷酸的合成而成为抗癌药或杀菌剂

1.  Asp结构类似物羽田杀菌剂(结构见P395),为有抗癌作用的抗生素,强烈抑制次黄嘌呤合成的第⑦步的酶(腺苷酸琥珀酸合成酶,以Asp为原料)。

2.  Gln结构类似物重氮丝氨酸和6-重氮-5-氧正亮氨酸(结构见P393),也为有抗癌作用的抗生素,抑制从头合成第①和第④步。

3.  THFA类似物氨甲喋呤,氨基喋呤(结构见P400),抑制从头合成第③和第⑨步,已成为临床应用的抗癌和抗病毒药物。

(5)  由嘌呤碱基和核苷合成核苷酸(补救途径):利用外源或降解产生的嘌呤碱和核苷合成核苷酸。重要的是由嘌呤碱与5-PRPP在磷酸核糖转移酶作用下形成嘌呤核苷酸。

腺嘌呤与5-PRPP反应生成 AMP和PPi

次黄嘌呤(或鸟嘌呤)与5-PRPP反应生成IMP(或GMP)和PPi

缺乏磷酸核糖转移酶会产生Lesch-Nyhan二氏综合病(遗传病),补救途径缺少,从头合成增加,会引起尿酸积累,导致肾结石和痛风,严重者自残。

(6)  调节:嘌呤核苷酸的从头合成受其两个终产物腺苷酸和鸟苷酸反馈控制(P396 图33-6)。

嘌呤类似物6-巯基嘌呤(6-MP),抑制从头合成第①步和由IMP生成AMP、GMP的从头合成反应及补救途径,为已临床使用的抗癌药。

(三)嘧啶核糖核苷酸的合成

(1)  从头合成:见P396 图33-7。先由氨甲酰磷酸和Asp合成二氢乳清酸,再氧化成乳清酸(形成嘧啶环),然后与5-PRPP生成乳清苷酸,失CO2形成UMP。

胞嘧啶核苷酸是在尿嘧啶核苷三磷酸(UTP)的水平上进行的,UTP由Gln氨基化生成CTP。

(2)  补救途径

1.  UMP:① 尿嘧啶与5-PRPP反应成UMP。

  ② 尿嘧啶与1-磷酸核糖反应先生成尿嘧核苷,再与ATP反应生成UMP。

2.  CMP:胞嘧啶核苷C被ATP磷酸化生成CMP。

(四)脱氧核糖核苷酸的合成

(1)  由核糖核苷酸还原形成,还原发生在核苷二磷酸(NDP)的水平上,酶为核糖核苷酸还原酶。

NDP(ADP,GDP,CDP,UDP)→dNDP(dADP,dGDP,dCDP,dUDP)。

NDP可由NMP与ATP形成。

另外dNMP也能利用已有的碱基和核苷合成。

(2)  胸腺嘧啶核苷酸的合成

由dUMP在胸苷合成酶催化下被甲基化生成dTMP,N5,N10-亚甲基THFA提供甲基后变成DHFA,DHFA在二氢叶酸还原酶作用下还原成THFA,再由Ser供甲基转变成N5,N10-亚甲基THFA(再生),使dUMP甲基化反应得以继续。

由dTMP合成开发了抗癌药5-氟尿嘧啶(5-Fu)和氨甲喋呤、氨基喋呤。

5-Fu在体内转变成氟脱氧尿苷酸F-dUMP,为dUMP和dTMP类似物,可抑制催化dUMP甲基化合成dTMP的胸苷合成酶;氨甲喋呤和氨基喋呤为DHFA的类似物,可抑制催化DHFA还原成THFA的二氢叶酸还原酶,使N5,N10-亚甲基THFA不能回复,从而使dUMP甲基化无法进行。

5-Fu及氨甲喋呤等可封闭dTMP合成。

癌细胞DNA合成水平增加,对dTMP需要量增高,dTMP合成阻遏可限制癌细胞生长。

核苷酸生物合成总结见P401 图33-12。

8-33  辅酶核苷酸的生物合成

烟酰胺核苷酸,黄素核苷酸和辅酶A等分子结构中包含有腺苷酸部分,因而这几种辅酶的合成亦与核苷酸代谢有关。

第九章  DNA的复制与修复  下册 P406  34下

DNA是生物遗传的主要物质,DNA复制即以原来DNA分子为模板合成出相同分子的过程。

9-1  DNA复制

生物系统的遗传信息主要表现为DNA分子中特异的核苷酸排列顺序。DNA整个分子复制,可以将遗传信息由亲代传给子代,碱基配对原理是遗传信息传递的基本机制。

(一)DNA的半保留复制:

一个亲代DNA分子变成两个子代分子,每个子代分子双链中一条来自亲代分子,一条是新合成的互补链,这种复制方式称为半保留复制。见P407 图34-2。

证实:同位素标记法

1.  在15NH4Cl培养基中连续培养E. coli 12代,制备15N标记的E. coli的DNA。

2.  半保留复制证实:将15N DNA的E. coli转移到14N氮源中培养,一代后,所有DNA密度介于15N-DNA和14N-DNA之间,形成一半含15N,一半含14N的杂合分子。两代后,14N分子和14N-15N杂合分子等量出现。

当把14N-15N杂合分子加热变性,可分开成14N-链和15N-链两条链,且这些亚单位经许多代复制仍保持完整性。

DNA半保留复制机制可以说明DNA在代谢上的稳定性,是所有已知基因的复制形式。即使一些病毒在生命周期一部分中出现单链DNA,但复制时必为双链DNA。

(二)DNA复制的起点和方式:

复制叉:DNA复制生长点处形为叉形,故称为复制叉。新DNA合成与亲代DNA解链在同一部位同时进行。

DNA复制时大多是双向进行,形成两个复制叉或生长点。也有单向的,只形成一个复制叉或生长点。见P408 图34-4。

对称复制:两条链同时进行复制。

不对称复制:一条链复制后再进行另一链的复制。

环形DNA复制时在显微镜下可以看到形如眼形的θ型结构。P409 图34-5。

P411 图34-8显示了DNA不同复制方式。

A:直线双向,  B:多起点双向,  C:θ型双向,  D:θ型单向, 

E:滚动环,  F:D环,  G:2D环。

细菌DNA复制叉移动速度大约为5万bp/分,E. coli完成复制40分钟,在丰富培养基中20分钟即可分裂一次。

(三)DNA聚合反应有关的酶:

(1)  DNA聚合反应和聚合酶

1.  DNA聚合反应需要下面五个要素

①  底物:四种脱氧核苷三磷酸(dATP,dGTP,dCTP和dTTP),统称为dNTP,且四种都必须存在。

②  模版:指导反应进行。模版可以是单链DNA,也可以是在一处或几处断开的双链DNA。

③  引物链:为具有3'-OH的RNA(体内)或DNA(体外)短链。

④  DNA聚合酶:为模板指导酶,按模版将一个个dNTP根据碱基配对原则催化加成在引物链的3'-OH端上。

⑤  Mg2+

2. DNA聚合酶反应特点:

①  以四种脱氧核糖核苷三磷酸为底物。

②  反应需接受模板指导。

③  反应需引物3'-OH存在。

④  DNA生长方向为5' → 3',新合成链与模板链互补。

⑤  产物DNA性质与模板相同,为模板复制物,与何种聚合酶及四种核苷酸前体的相对比例无关。

(2)  大肠杆菌DNA聚合酶

E. coli共含有五种不同的DNA聚合酶。

1.  DNA聚合酶Ⅰ

单一多肽链,分子量103000,是一个多功能酶,可以催化以下反应:

①  聚合反应,使DNA链沿5' → 3'方向延伸。

②  由3'端水解DNA链,为3' → 5'核酸外切酶,可迅速切除错配的核苷酸,具有校对功能,使DNA复制错误率从10-5降至5×10-7。

③  由5'端水解DNA链,为5' → 3'核酸外切酶,用于DNA合成中切除引物及DNA损伤修复。

④  由3'端使DNA链发生焦磷酸解,为聚合反应逆反应。

⑤  无机焦磷酸盐与dNTP之间焦磷酸基交换。

此酶在E. coli体内由于催化聚合速度慢,主要负责切除和修复。

DNA聚合酶Ⅰ被蛋白水解酶有限水解,可生成两个片断:大片断称为Klenow片断,有聚合酶和3' → 5'核酸外切酶活性;小片断具有5' → 3'核酸外切酶活性。

2.  DNA聚合酶Ⅱ和Ⅲ:

均为多亚基酶,均有聚合DNA和3' → 5'核酸外切酶活力,但无5' → 3'  外切酶活力。聚合酶Ⅱ可能与DNA修复有关,聚合酶Ⅲ由于催化合成速度达到了体内DNA合成速度(为聚合酶Ⅰ的100倍),是E. coli真正负责重新合成DNA的复制酶。

新近发现的DNA聚合酶Ⅳ和Ⅴ,参与易错链的修复。

3.  DNA连接酶:

DNA聚合酶只能催化链延长,而催化两条链的末端之间形成共价连接则由连接酶完成。

连接酶要求:

一条DNA链3'端有自由OH,另一条DNA链5'端有一磷酸基因,连接反应需供能,细菌由NAD供能,动物和噬菌体由ATP供能。

P417 图34-17  DNA连接酶催化的反应。

一般要求需要连接的两条链,由互补链将它们聚在一起形成双螺旋结构(使缺口闭合),而不能将两条游离的DNA分子连接起来。

(四)DNA的半不连续复制:

(1)  问题的提出:

DNA两条链反向平行,一条链走向为5' → 3',另一条链为3' → 5',但所有DNA聚合酶合成方向都是在引物3'-OH上合成,使链从5' → 3'延长,那么5' → 3'链是如何同时作为模板复制呢?

1968年冈崎提出DNA不连续复制模型(P418图34-18),认为新合成的3' → 5'走向的DNA链实际上是有许多5' → 3'方向合成的DNA片断连接起来的。

(2)  DNA半不连续复制:

DNA复制时,以3' → 5'走向为模板的一条链合成方向为5' → 3',与复制叉方向一致,称为前导链;另一条以5' → 3'走向为模板链的合成链走向与复制叉移动的方向相反,称为滞后链,其合成是不连续的,先形成许多不连续的片断(冈崎片断),最后连成一条完整的DNA链。

(3)  DNA合成由RNA引物引发:

DNA聚合酶不能发动新链的合成,只能催化已有链的延长;RNA聚合酶则不同,只要有模板存在,不需引物,就可以合成新RNA链。因此在体内先由RNA聚合酶合成RNA引物,DNA聚合酶再从RNA引物的3'-OH端开始合成新的DNA链。催化RNA引物合成的酶称为引物合成酶。

引物长度通常只有几个~10多个核苷酸,冈崎片断合成也需要引物。RNA引物的消除和缺口填补是由DNA聚合酶Ⅰ完成的,最后由DNA连接酶连接。

(4)  DNA复制的复杂性保证了复制的高度忠实性。

E. coli复制时,每个碱基对错配频率为10-9~10-10,是高保真系统。

新DNA链合成时需引物,引物后又要切除,再以DNA链取代,DNA聚合酶在合成时还有校对功能,每引入一个核苷酸都要复查一次,未核实则不能继续进行聚合反应。

在复制过程中还有许多辅助蛋白,E. coli就至少有15种。复制叉的复杂结构进一步提高复制准确性。

DNA复制还存在正调控和负调控,调控分子可以是蛋白质,也可以是RNA。

(五)DNA复制的拓扑性质:

DNA复制时首先需将超螺旋解开。DNA拓扑异构酶Ⅰ通过切断与封闭DNA骨架上的磷酸二酯键而使DNA解旋,此过程热力学有利,不需ATP,每次反应改变ΔL=+1;具有类似功能还有拓扑异构酶Ⅲ。DNA复制后,由拓扑异构酶Ⅱ使DNA连续引入负超螺旋,需能由ATP供给,每次反应改变DNA连环数为ΔL=-2。

在DNA解链后,由单链结合蛋白(SSB)覆盖,稳定DNA单链,阻止DNA复性和保护不被核酸酶降解。

(六)DNA复制的过程:

DNA复制可分为三个阶段:起始、延伸和终止。其间的反应和参与作用的酶与辅助因子各有不同。在DNA合成的生长点即复制叉上分布着各种各样与复制有关的酶和蛋白因子(至少50种以上),它们构成的复合物称为复制体。大肠杆菌复制体结构示意图如P423 图34-22所示。

复制体的基本活动包括:① 双链的解开;② RNA引物的合成;③ DNA链的延长;④ 切除RNA引物,填补缺口,连接DNA片断;⑤ 切除和修复错配碱基。

真核生物的DNA通常都与组蛋白结合,构成核小体,以染色质的形式存在于细胞核中。复制过程需疏松染色质和解开核小体,复制后又需装配并凝缩成染色体,再分配到两个子细胞中去。真核生物有五种DNA聚合酶,其中DNA聚合酶α合成引物,δ是复制酶,γ是线粒体合成酶,β和ε是修复酶。

真核生物染色体DNA的末端有端粒结构,端粒是由端粒酶合成的。端粒是由许多成串短的重复序列组成,该重复序列通常一条链上富含G,而其互补链上富含C。人的端粒为TTAGGG,TG链常比AC链更长些,形成3'单链末端。端粒的功能为稳定染色体末端结构,防止染色体间末端连接,并可补偿滞后链5'末端在消除RNA引物后造成的空缺。复制使端粒5'末端缩短,而端粒酶可外加重复单位到5'末端上,结果维持端粒一定长度。

端粒酶是一种催化合成含有约150个碱基的RNA链的逆转录酶,它以酶中所含RNA为模板合成DNA的3'末端(P427 图34-24),合成一个重复单位后酶再向前移动一个单位。

在动物生殖细胞中,由于端粒酶的存在,端粒一直保持着一定的长度,体细胞随着分化而失去端粒酶活性。在缺乏端粒酶活性时,细胞连续分裂将使端粒不断缩短,短到一定程度即引起细胞生长停止或凋亡。端粒在决定细胞寿命中起重要作用,经过多代培养老化的细胞端粒变短,染色体也变得不稳定。然而,主要的肿瘤细胞中均发现存在端粒酶活性,因此设想端粒酶可作为抗癌治疗的靶位点。

9-2  DNA的损伤修复

DNA复制过程中可能产生错配,DNA重组,基因的整合等都会局部破坏DNA双螺旋结构。某些物理化学因素,如紫外线,辐射和化学诱变剂等都能使DNA结构和功能破坏,从而引起生物突变、致癌甚至死亡。

为此生物已进化了如下一些保护自己,修复损伤DNA的系统。

(一)错配修复:识别错配位点以及“新”“旧”链,将错配新链切除并加以修复。如E. coli体内有一种甲基化酶,使DNA序列中腺嘌呤N6位甲基化(可维持数分钟),发现错配碱基,即将未甲基化的新链切除。E. coli参与错配修复的蛋白质至少有12种。

(二)光复活修复(直接修复):它分解紫外线引起的嘧啶二聚体。光照下光复活酶激活,分解嘧啶二聚体,如P429 图34-28。这种修复对植物特别重要,高等动物没有。

(三)切除修复:在一系列酶作用下,将DNA分子中受损伤部分切除掉,并以完整的那一条链为模板,合成切去的部分,然后使DNA恢复正常。是比较普遍的修复机制,有多种酶参加,见P430 图34-29。切除修复若有关酶缺乏,可导致癌症,如紫外线引起的DNA损失若不能修复,会出现皮肤癌。

  切除修复为复制前修复。

(四)重组修复:为复制后修复。当DNA发动复制时尚未修复的损伤部位先复制再修复,如P430 图34-30所示。复制时遇损伤部位先跳过去,在子代链对应损伤处先留下缺口,然后从另一条完整DNA母链上将相应核苷酸序列片断移至子链缺口处,最后再用合成的序列来补上母链的空缺。也有一系列酶参加。

(五)应急反应(SOS)和易错修复:上述DNA损伤修复功能可以不经诱导而发生。而许多能造成DNA损伤或抑制复制的处理却能引起一系列复杂的诱导效应,称为应急反应。SOS反应包括诱导DNA损伤修复、诱变效应、细胞分裂的抑制等。细胞癌变可能与SOS反应有关。

  SOS反应是细胞DNA受到损伤或复制系统受到抑制的紧急情况下,为求生存而出现的应急效应。SOS反应诱导的修复系统包括避免差错的修复和易产生差错的修复两类。易产生差错的修复会导致变异,变异一方面有利于生物进化,另一方面可致癌。大多致癌因素如X-射线,黄曲霉素等都能在细菌中诱导产生SOS反应,由此可根据细菌的SOS反应检测对动物诱发肿瘤的致癌物。

9-3  DNA的突变

  DNA作为遗传物质有三个功能:复制,转录和变异(包括突变和遗传重组)。

(一)突变类型:

(1)  碱基对置换:原来一个碱基被另一碱基所取代。

(2) 移码突变:由于一个或多个非三整倍数的核苷酸对的插入或缺失,使该位点后三联体密码改变,导致后向氨基酸都发生错误。

(二)诱变剂的作用:

提高突变率的物理或化学因子称为诱变剂,常见的有:

(1)  碱基类似物,如5-溴尿嘧啶。

(2)  碱基修饰剂,HNO2脱去碱基上氨基;氮芥等烷基化剂,使碱基N-烷基化后断糖苷键而脱落,又可使同一条链或两条不同链上鸟嘌呤连成二聚体,两条DNA链交连而致癌。

(3)  嵌入染料:一些扁平的稠环分子,如吖啶等造成链错位,导致移码突变。

(三)诱变剂和致癌剂的检测:

(1)  Ames试验:检测诱变剂和致癌剂。

(2)  利用溶原菌被诱导产生噬菌斑法检测致癌剂。

  第十章  RNA的生物合成和加工  下册 P455  36下

贮存于DNA的遗传信息需通过转录和翻译而得到表达。通过转录在RNA聚合酶催化下合成细胞内各种RNA(mRNA、r-RNA、t RNA和具有各种特殊功能的小RNA),转录的RNA产物通常要经过一系列加工和修饰才能成为成熟的RNA分子,遗传信息表达过程中存在复杂调控机制。

RNA携带遗传信息(RNA为信息分子)可以指导RNA合成(复制),也可以指导DNA合成(逆转录);RNA还具催化(核酶)等多种功能(RNA为功能分子)。

10-1  DNA指导下的RNA合成

转录:是以DNA分子为模板合成与其核苷酸顺序相对应的RNA分子的过程。

基因是遗传物质的最小功能单位,相当于DNA一个片段。一个转录单位可以是一个基因也可以是多个基因。

基因的转录是一种有选择性的过程,随着细胞的不同生长发育阶段和细胞内外条件的改变将转录不同的基因。

(一)转录

(1)DNA指导下的RNA聚合酶:

该酶所需底物:四种核糖核苷三磷酸(ATP,GTP,UTP及CTP)。

模板:双链DNA或单链DNA。

Mg2+:促进聚合。

不需引物,合成方向也是5'→3'。

催化聚合反应产生的PPi水解推动反应向前。

RNA酶无校对功能。

(2)不对称转录:

在体内DNA两条链中仅有一条链可用于转录,某些区域以这条链转录,另一些区域则可以另一条链转录。

用于转录的链称为模板链或负链(-DNA),对应的链为编码链,即正链(+DNA)。编码链与转录出来的RNA链碱基序列一样,只是以U取代T,它无转录功能,只能进行复制。

RNA转录时无需将DNA双链完全解开,RNA聚合酶能够局部解开DNA的两条链,并以其中一条链为有效的模板,在其上合成出互补的RNA链,合成的RNA链随DNA双链恢复而离开DNA链。

P456 图36-1  E. coli  RNA聚合酶进行转录。

(3)  E. coli的RNA聚合酶:

全酶由五个亚基(α2ββ'σ)组成,相对分子量465,000。没有σ亚基的酶(α2ββ')叫核心酶,只能使已开始合成的RNA链延长,而不具有起始合成RNA的能力。开始合成的RNA链时必须有σ亚基参与作用,σ亚基为起始亚基。

  (4)转录反应四阶段:

模板的识别,转录的起始、延伸和终止。

1. 识别:RNA聚合酶在σ亚基引导下识别并结合到启动子上,DNA双链局部解链,形成转录泡(解链区)。

2. 起始:在模板链上通过碱基配对合成最初RNA链,σ亚基脱离核心酶,酶离开启动子。

3. 延伸:核心酶向前移动,RNA链不断生长,并在解链区形成RNA-DNA杂交体,然后DNA恢复双螺旋结构,RNA链被置换出来。

4. 终止:RNA聚合酶到达基因转录终点,在Nus因子帮助下识别转录终止信号,停止RNA链的生长,酶与RNA链离开模板,DNA恢复双螺旋结构。

P457 图36-2  RNA聚合酶催化的转录过程。

真核生物的RNA聚合酶分子为Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ三种,分别转录rRNA、mRNA和小RNA。

(二)启动子和转录因子

启动子:RNA聚合酶识别、结合和开始转录的一段DNA序列。

原核生物启动子:有两个保守序列,位于-10的pribnow框和位于-35的识别区,-10区位于转录开始位置上游(向左)约10个核苷酸处,-35区位于上游约35个核苷酸处。(转录单位起点核苷酸为+1,转录起点左侧为上游,用负的数码表示,起点后为下游,为转录区)。

-10区:6个bp的保守序列TATAAT,含较多的A-T碱基对,有助于DNA双链局部解开。

-35区:序列为TTGACA,中心在-35处,RNA聚合酶的识别区域,为酶提供识别信号。

真核生物的启动子有三类,分别由RNA聚合酶Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ进行转录。真核生物的启动子由转录因子而不是RNA聚合酶所识别。启动子通常由一些短的保守序列所组成,可被适当种类的辅助因子识别。

(三)终止子和终止因子

终止子:提供转录停止信号的DNA序列。

终止因子:协助RNA聚合酶识别终止信号的辅助因子(蛋白质)。

DNA转录终止信号可被RNA聚合酶本身或其辅助因子所识别。

所有原核生物的终止子在终止点前均有一回文结构,产生的RNA可形成发夹结构。

通读:有些终止子的作用可被特异因子所阻止,使酶得以越过终止子继续转录,称为通读。这类引起抗终止作用的蛋白质称为抗终止因子。

抗终止作用主要见于某些噬菌体的时序控制。早期基因与其后基因之间以终止子相隔开,通过抗终止子可以打开其后基因的表达,新的基因表达是由于RNA链延长

所致。

RNA聚合酶识别终止子也需要一些特殊的辅助因子,如Nus A因子可提高终止效率,促进RNA聚合酶在终止位置上的停顿。Nus A与核心酶结合成终止复合物,识别终止信号。转录终止后,Nus A又被σ所取代,再形成RNA聚合酶起始复合物。

(四)转录的调节控制

转录的调节是基因表达调节的重要环节,包括时序调节和适应调解。遗传信息的表达可按一定时间程序发生变化,而且随着细胞内外环境条件的改变而加以调整。

原核生物的操纵子:它既是表达单位,也是协同调节的单位。

操纵子是细菌基因表达和调控的单位,它包括结构基因、调节基因和由调节基因产物所识别的控制序列。

操纵子模型,见P561。

由于经济原则,细菌通常并不合成那些在代谢上无用的酶,因此一些分解代谢的酶类只在有关的底物或底物类似物存在时才被诱导合成。如E. coli利用外界乳糖时会需要三种有关的酶,一般情况下极少产生,只有当乳糖存在时,按乳糖操纵子模型这三种利用乳糖所必需的酶才大量产生。

一些合成代谢的酶类在产物或产物类似物足够量存在时,其合成则被阻遏。

P562 图39-21  说明酶诱导和阻遏的操纵子模型。

酶的诱导和阻遏是在调节基因产物—阻遏蛋白的作用下,通过操纵基因控制结构基因或基因组的转录而发生的。

A.  酶的诱导:阻遏蛋白结合在操纵基因上,结构基因不表达;但当诱导物与阻遏蛋白结合使阻遏蛋白不能结合在操纵基因上,结构基因可以表达。

B.  酶的阻遏:阻遏蛋白不能与操纵基因结合,结构基因可表达;当代谢产物与阻遏蛋白结合使阻遏蛋白能够结合在操纵基因上,结构基因不表达。

P563 图39-22  为E. coli中乳糖操纵子模型。

调节有正调节和负调节,原核生物以负调节为主。

阻遏蛋白的作用属于负调节,阻遏蛋白称为负调节因子。

正调节:调节蛋白(激活子)与DNA结合时,使转录发生。

真核生物的调节更为复杂,基因不组成操纵子,以正调节为主,并可在染色质结构水平上进行调节。

(五) RNA生物合成抑制剂

(1)  碱基类似物:可作为核苷酸代谢拮抗物而抑制核酸前体的合成,直接抑制核苷酸生物合成有关的酶,或通过掺入到核酸分子中形成异常的DNA或RNA影响核酸的功能并导致突变:

如  6-巯基嘌呤,  6-巯基鸟嘌呤,  5-氟尿嘧啶等,结构式见P469。

(2)  DNA模板功能抑制物:通过与DNA结合,使DNA失去模板功能从而抑制其复制和转录:

如临床上应用的氮芥类似物。(结构见P470)。

环磷酰胺:体外无活性,进入肿瘤细胞后受磷酰胺酶作用水解成活性氮芥,可治疗多种癌症。

苯丁酸氮芥:因含有酸性基团不易进入正常细胞,而癌细胞酵解作用旺盛,大量积累乳酸,pH较低,故容易进入癌细胞。

10-2  RNA的转录后加工

细胞中由RNA聚合酶合成的原初转录物往往需经过一系列变化,包括链的裂解,5'端与3'端的切除和特殊结构的形成,核苷的修饰和糖苷键的改变以及拼接和编辑,才能转变为成熟的RNA分子,此过程为转录后加工或称RNA的成熟。

(一)原核生物中RNA的加工

mRNA一般不进行转录后加工,一经转录通常立即进行翻译。

rRNA的基因与某些tRNA基因组成混合操纵子,转录后需切割,断链成为rRNA和tRNA,如P473 图36-13  大肠杆菌rRNA前体的加工:rRNA前体先经甲基化修饰,再被切割。

tRNA前体加工包括:由内切酶在tRNA两端切断;3'端切去附加顺序,进行修剪;3'端加上-CCA-OH;核苷酸修饰和异构化,ψ和T由U修饰而来。

(二)真核生物中RNA的一般加工

大多数真核基因都是断裂基因,转录产物需通过拼接,去除插入部分(即内含子),使编码区(外显子)成为连续序列。

RNA编码序列改变称为编辑,RNA编码和读码方式的改变称为再编码。由于存在选择性拼接、编辑和再编码,一个基因可以产生多种蛋白质。

真核生物mRNA前体必须经复杂加工过程,还有5'端加帽子,3'端加polyA。

rRNA和tRNA加工也需剪接、编辑、内部甲基化、修饰异物化、戴帽和加尾。

(三)酶性核酸

四膜虫rRNA的拼接是自我催化下进行,拼接过程没有蛋白质参加,为自我拼接。

RNA拼接有四种方式,如P479 图36-17。四膜虫rRNA前体拼接属于类型Ⅰ自我拼接。Ⅰ型内含子具有高度保守的二级结构(P480图36-19)和三级结构,导致某些活性部位形成。

P479 图36-18  四膜虫rRNA前体的拼接过程:

A: 第一次转酯反应,鸟苷酸(或鸟苷)提供游离的3'-OH,使内含子的5'-磷酸基转移其上。

B: 第二次转酯反应,由第一个外显子产生的3'-OH攻击第二个外显子的5'-磷酸基,产生线状内含子片段。

C: 第三次转酯反应,线状内含子片段发生环化,形成一个环状分子和一小段15聚核苷酸。

类型Ⅱ内含子自我拼接如P480 图36-20所示。它无需游离鸟苷酸(或鸟苷)发动转酯反应,而是由内含子靠近3'端的腺苷酸2'-OH攻击5'磷酸基引起的,经过两次转酯反应,内含子成为套索结构被切除,两个外显子得以连接在一起。

(四)RNA生物功能的多样化

(1)  RNA在遗传信息的翻译中起着决定作用,承担蛋白质生物合成。

(2)  RNA具有重要催化功能和其他持家功能。

(3)  RNA转录后加工和修饰依赖于各种小RNA和其蛋白质复合物。

(4)  RNA对基因表达和细胞功能具有重要调节作用。

反义RNA可通过与靶部位序列互补而与之结合或直接阻止其功能或改变靶部位构象而影响其功能。

(5)  RNA在生物进化中起重要作用。

生命起源早期可能首先出现的是RNA。

   总之,DNA和RNA是主要遗传信息携带分子,RNA还是重要的功能分子,在遗传信息的传递、加工和调节中起关键作用。

10-3  在RNA指导下的RNA和DNA合成

在有些生物中,RNA也可以是遗传信息的基本携带者。

(一)RNA复制:以RNA为模板,在RNA复制酶催化下合成与模板互补的全序列RNA称为RNA复制。

(1)  RNA复制酶:

模板特异性很高,它只识别病毒自身的RNA。

底物为四种NTP,不需引物,需Mg2+。

(+)RNA和(-)RNA:通常将具有mRNA功能的链称为(+)RNA,而它的互补链为(-)RNA。

带(+)RNA的病毒可直接进行与病毒繁殖有关的蛋白质合成。

1.  (+)RNA病毒:如灰质炎病毒和噬菌体Qβ。

2.  (-)RNA病毒:含有复制酶,如狂犬病病毒。

3.  (±)RNA病毒:含双链DNA和复制酶,如呼肠孤病毒。

4.  逆转录病毒:致癌RNA病毒,如白血病病毒,AIDS病毒。

P493 图36-34  显示RNA病毒合成mRNA的四种途径。

(二)RNA的逆转录

以RNA为模板在逆转录酶作用下合成DNA,遗传信息由RNA传给DNA。

(1)  逆转录酶的发现:

1964年Temin发现致癌RNA病毒(不含DNA)的复制受到DNA合成抑制剂放线菌素的抑制,为此Temin提出“前病毒”学说,认为遗传信息可以由RNA传递给DNA,存在逆转录传递。

1970年从致癌RNA病毒中发现逆转录酶。

(2)  逆转录酶的性质:

模板:RNA。以自身病毒的RNA为模板时活力最高。一些人工合成的多聚核苷酸也表现出很高模板活力,如polyC-dG,可在提纯逆转录酶时用作测酶活力的模板。真核生物mRNA  3'端有poly A,可作为逆转录模板(加dT),可制cDNA。

引物:长度至少要4个核苷酸,可为寡聚DNA,也可为寡聚RNA,如病毒RNA逆转录要求特定tRNA为引物,需有3'-OH。

底物:四种dNTP。

Mg2+和Mn2+;还需要保护酶中-SH的还原剂。

逆转录酶是多功能酶,有3种酶活力:

1. 形成杂合分子RNA-DNA,为RNA指导下DNA聚合活力。

  2. 形成双链DNA,为DNA指导下的DNA聚合活力。

  3. 水解RNA-DNA杂合分子中的RNA,核酸外切酶活力。

  逆转录酶无校正功能,因此错误率较高。

(3)  逆转录的生物学意义

逆转录最初发现于致癌RNA病毒,但并不仅限于病毒,在细胞中也频繁发生,但要在一定条件下才表达。端粒酶就是一种逆转录酶,其活性只存在于胚胎和肿瘤细胞中。

致癌病毒:逆转录产生的前病毒DNA可通过重组与宿主DNA组合在一起,如果重组病毒携带了控制细胞生长分裂的原癌基因,使其以异常高的水平表达或经突变失去了调节机制,就成为癌基因。

AIDS病:HIV病毒侵入T淋巴细胞后即杀死细胞,造成宿主机体免疫系统损伤。由此设计药物作用靶部位:HIV的逆转录酶,如AZT(叠氮胸苷),在T淋巴细胞内转变成AZT三磷酸,与dTTP竞争与HIV的逆转录酶结合而作用。

第十一章  蛋白质的生物合成

11-1  遗传密码  (下册 P504,37章)

蛋白质是生物主要的功能分子,它参与所有的生命活动过程,并起着主导作用。

蛋白质的合成由核酸所控制,决定蛋白质结构的遗传信息编码在核酸分子中。

遗传密码:编码氨基酸的核苷酸序列,通常指核苷酸三联体决定氨基酸的对应关系。

(一)三联密码:

核酸分子中只有四种碱基,要为蛋白质分子20种氨基酸编码。三个碱基编码64个,又称三联密码。

密码子:mRNA上有三个相邻核苷酸组成一个密码子,代表某种氨基酸、肽链合成的起始或终止信号。

蛋白质翻译:在RNA控制下根据核酸链上每3个核苷酸决定一种氨基酸的规则,合成出具有特定氨基酸顺序的蛋白质过程。

64个密码子破译后,编写出的遗传密码字典。见P511 表37-5。

(二)遗传密码的基本特性

(1)  密码的基本单位

遗传密码按5'→3'方向编码,为不重叠、无标点的三联体密码子。

起始密码子兼Met:AUG。

终止密码子:UAA、UAG和UGA。

其余61个密码子对应20种氨基酸。

(2)  密码的简并性

同一种氨基酸有两个或更多密码子的现象称为密码的简并性。

同一种氨基酸不同密码子称为同义密码子,氨基酸密码子的简并见P512

表37-6。

简并可以减少有害突变,对物种稳定有一定作用。

(3)  密码的变偶性(摆动性)

编码同一个氨基酸的密码子前两位碱基都相同,第三位碱基不同,为变偶性。即密码简并性往往表现在密码子第三位碱基上,如Gly的密码子为GGU、GGC、和GGA。

(4)  密码的通用性和变异性

通用性:各种低等和高等生物,包括病毒、细菌及真核生物基本上共用一套遗传密码。

变异性:已知线粒体DNA(mtDNA),还有原核生物支原体等少数生物基因密码有一定变异。

(5)  密码的防错系统

密码的编排方式使得密码子中一个碱基被置换,其结果常常是编码相同的氨基酸或是为物理化学性质接近的氨基酸取代。

11-2  蛋白质合成及转运  下册 P517

1、氨基酸是怎样被选择及掺入到多肽链当中去的。

2、多肽链在核糖体上合成完后,其翻译后化学修饰是怎样进行的。

3、合成加工好的蛋白质是怎样被运送到其发挥功能的地方。

(一)mRNA是蛋白质合成的模板

DNA在细胞核内,蛋白质合成在细胞质中,DNA的遗传信息是由mRNA传递到蛋白质上。mRNA是半寿期很短的物质,肽链上各个氨基酸排列顺序是由mRNA上核苷酸排列顺序决定的。

(二)tRNA转运活化的氨基酸至mRNA模板上

tRNA的3'端为接受臂,是氨基酸结合部位。反密码环含反密码子,可识别mRNA密码子,另外还有识别氨酰-tRNA合成酶的位点。

20种氨基酸每一种至少有一种tRNA负责转运,书写时,将所转运的氨基酸写在tRNA右上角,如tRNAphe只转运Phe,大多数氨基酸都有几种专用来转运自己的tRNA。

(三)核糖体是蛋白质合成工厂

(1)  每个真核细胞可有106~107个核糖体。核糖体都有两个亚基组成(原核生物为30S和50S,真核生物为40S和60S),每个核糖体有两个tRNA位点:一个A位,氨酰tRNA位点;另一个P位,肽酰tRNA位点。

(2)  还有结合mRNA的位点,一个mRNA分子可以与一定数目的单个核糖体结合,形成念珠状,称为多核糖体。

(3)  核糖体还有许多与起始因子、延伸因子、释放因子及与各种酶结合的位点。

r-RNA在核糖体中即有结构上的功能,又参与转译过程。

(四)翻译的步骤

肽键合成时延伸的方向是从N端到C端,mRNA上信号被转译的方向是从5'端到3'端。

(1)  氨酰-tRNA的形成

在氨酰-tRNA合成酶作用下完成,使氨基酸活化。该酶有较高的专一性,即对氨基酸又对tRNA有高度选择性,以防止错误的氨基酸掺入多肽。且可校正错误,错误活化的氨基酸可被水解下来。

一旦形成氨酰-tRNA后,氨基酸的去向就由tRNA来决定。

(2)  翻译开始于mRNA与核糖体的结合

大肠杆菌多肽合成的第一步是70S起始复合物的形成,mRNA上的起始密码子AUG,30S及50S核糖体亚基,起始氨基酸及起始tRNA等参与这一复杂过程。

(3)  肽链的延伸分三步进行:一个新进入的氨酰-tRNA结合到70S核糖体A位点上,然后肽酰基从P位点转到A位点上,并形成肽键。核糖体沿mRNA位移,mRNA上的下一个密码子又进入A位点。氨酰-tRNA从A位点上移位到P位点,tRNA离开P位点,完成延长一个氨基酸的肽链合成。然后再开始新的一轮肽链延伸反应。

(4)  肽链合成的终止和释放,翻译的终止需要释放因子和终止因子的参加,这一过程除了需要mRNA的终止信号外,还需要核糖释放因子参与核糖体与mRNA的解离。释放因子在A位结合,肽链水解离开核糖体,核糖体离解成亚基,mRNA离开。

(5)  真核细胞中情况略有不同,起始复合物大小为80S,起始氨基酸为甲硫氨酸(而不是原核细胞所用的N-甲酰甲硫氨酸),起始tRNA也不同,起始密码子为AUG。涉及到的蛋白因子也较多。肽链延伸与终止过程中的延伸因子与信号释放因子也不同。

(6)  许多抗生素和毒素是多肽合成抑制剂,如氯霉素、四环素、链霉素等只抑制原核细胞的翻译,但不作用于真核细胞。

第十二章  基因工程  下册 P580  40下

12-1  基因工程

是对携带遗传信息的分子进行设计和施工的分子工程,包括基因重组、克隆和表达。核心是构建重组体DNA的技术。

(一)DNA克隆

将DNA限制酶切片段插入克隆载体,导入宿主细胞,经无性繁殖以获得相同的DNA扩增分子。

(1)  DNA限制酶和连接酶:

限制酶可将DNA切割成平末端或黏性末端,互补黏性末端之间碱基配可促使连接反应容易进行。

相容的限制片段可用DNA连接酶相连接,DNA的黏性末端和平末端连接见P582 图40-1。

(2)  分子克隆的载体与宿主系统:

载体:将外源DNA带入宿主细胞并进行复制的运载工具。

克隆载体通常是由质粒、病毒(如λ-噬菌体)或一段染色体DNA改建而成。

质粒是染色体外自主复制的遗传因子,多为共价闭环DNA分子,常用作细菌与真菌的克隆载体。如用限制性酶切割环形质粒DNA,制备一个具黏性末端的开环质粒分子。

作为克隆载体应具有自主复制能力,有易于筛选的选择标记,如含有抗药基因等。

宿主细胞应根据载体的性质来选定,应易于接受外源DNA,且易于生长和筛选。

(3)  外源基因导入宿主细胞:

欲引入的外源目标DNA经限制酶切割后应与载体有同样的黏性末端,用连接酶将外源DNA片段和载体连接成外源基因。

用CaCl2等方法,使E. coli等宿主细胞处于感受态,从而将外源基因导入细胞。

此外还有电穿孔法等使外源DNA高效导入细胞。

最后分离筛选出带有目的基因的重组体并进行克隆(可按重组体某种特征,如抗药性选择、营养标记选择等在特定培养基上进行筛选后繁殖形成菌落。每个菌落的细胞将含有同样的重组质粒DNA,这些质粒DNA又含有同样外源DNA片段)。

(二)基因文库

(1)  基因文库的构建: P589

基因文库是指整套由基因组DNA片段插入克隆载体获得的分子克隆之总和。

理想情况下基因文库应包含该基因组的遗传信息。

基因文库的构建包括基因组DNA的随机片段化、载体DNA的制备、重组DNA的体外包装、重组噬菌体感染大肠杆菌、基因文库的鉴定和扩增等步骤。

(2)  cDNA文库的构建:

真核生物基因是断裂的,需经RNA转录后加工过程才使编码序列拼接在一起。若将加工成熟的mRNA经逆转录合成互补的DNA(cDNA),接上原核生物表达控制元件,在原核生物表达。

通过cDNA还可研究不稳定的mRNA。

cDNA文库是指细胞mRNA逆转录成cDNA并被克隆的总和。

12-2  聚合酶链反应  P595

简称PCR(Polymerase  Chain  Reaction),为DNA体外酶促扩增,又称为无细胞分子克隆法。

(一)PCR基本原理

将DNA聚合反应所需五大要素集中在体外缓冲液中,可合成与模板互补的DNA新链。

(1)  DNA聚合酶:可采用耐热的Tag DNA聚合酶。但Tag酶无校正功能,PCR产物易发生错误。现已有多种具有校正功能的耐热DNA聚合酶作为商品出售。

(2)  模板:欲扩增的DNA,通常只需1pg~1ng。加热变性后两条链均可作为模版。

(3)  引物:两条模板两个引物。为取得PCR成功首先条件是设计好引物。

① 引物长度应大于16个核苷酸。② Tm 550。③ 引物无发夹结构。④ 两引物间不应有大于4bp以上的互补序列或同源序列。⑤ 引物中碱基分布均匀,G+C含量接近50%。

(4)  四种dNTP底物。

(5)  mg2+。

(二)PCR最适条件

开始在940C加热5~10分钟,使DNA模板完全变性,然后进入热循环。

(1)  变性:940C下45秒到1分钟,DNA双链解开。

(2)  退火:约91~920C 1分钟,引物与模板两端附着结合。(最适退火温度由实验确定)

(3)  延伸:720C  1~1.5分钟,新DNA链形成。

最后一次延伸时间10分钟。

以上条件用于扩增300~500bp长的DNA片段,若扩增更长的DNA,反应时间可以适当延长。

(三)PCR技术的发展与应用  见P596

  广泛用于扩增单个DNA,DNA测序,疾病诊断,人类基因疾病鉴定和法医鉴定等,为发展最迅速应用最广泛的成熟生物技术之一。







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