蛋白质组学

SILAC技术的原理介绍

10年前,SILAC诞生于南丹麦大学。它的***是Matthias Mann教授。2005年,这位牛人教授来到了德国慕尼黑的马普生物化学研究所。SILAC的全名为stable-isotope labelling by amino acids in cell culture。它的原理很简单:两组细胞同时培养,A组是在包含正常氨基酸(light)的培养基中;B组的培养基则含有“重型(heavy)”的氨基酸,即稳定同位素标记的氨基酸。初SILAC使用的标记氨基酸是氚代甲硫氨酸和氘代甘氨酸,目前常用的标记氨基酸有亮氨酸、精氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸和酪氨酸等。细胞传代若干代后,稳定同位素标记的氨基酸掺入到蛋白中,取代了原有的氨基酸。这样,两个蛋白之间就存在分子量的改变,而其它化学性质无异。

然后将两组细胞混合,提取出蛋白质组,并交给质谱去测定。每个肽段作为质谱中的一对——低分子量的肽段含有轻型氨基酸,来源于A组,高分子量的肽段则含有重型氨基酸,来源于B组。如果SILAC肽段对呈现1:1的比例,则蛋白质组中此蛋白的丰度无差异。如果含有重型氨基酸的肽段峰强度偏高,则说明B组中蛋白丰度更高。因为稳定同位素标记的氨基酸与天然氨基酸的化学性质基本相同,除了分子量差异,则质谱上峰强度的比值直接对应了A组与B组的比例。虽然整个实验的时间主要取决于细胞生长的速率和所采用的各种样品处理步骤,但一般来说,SILAC实验从开始到结束,包括数据分析,大约需要20到25天。

SILAC方法有很多优势。细胞在传代6-8代之后,蛋白标记效率可达90%以上。标记是在样品处理前引入,随后进行蛋白质分离、酶切和鉴定,后续实验对样品的影响一致,故样品处理所带来的定量误差(bias)会很低。在检测极低水平的蛋白变化或**后修饰时,这一点特别有用。此外,SILAC灵敏度高,样本量要求少,通常每个样品只需要几十微克的蛋白量。

当然,这种方法也有限制。一些细胞会将高浓度的精氨酸转化成脯氨酸,这样在精氨酸标记的情况下会产生两个不同的重型峰,代表了精氨酸或脯氨酸标记的肽段。研究人员也开发出一些方法,来避免这种转化。对于那些很难培养,或对培养基成分变化极其敏感的细胞系而言,这种代谢标记的方法也不大奏效。此外,这种技术也有可能影响生物体发挥功能,因为培养条件已改变。





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