蛋白质组学

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳FQA(二)

9.电泳的条带过粗

电泳中条带很粗是常见的事,主要是浓缩胶的原因。

处理办法:适当增加浓缩胶的长度;保证浓缩胶贮液的pH正确;适当降低电压。

10.目的蛋白质条带模糊

电泳凝胶浓度选择不当。

低于10Kd的小分子蛋白质要用Tricine胶。

靠近前沿的电泳带分辨率不佳。根据分子量与凝胶孔径的关系,选择适当浓度的凝胶。

蛋白质样品水解。注意除去蛋白质样品的内源性的水解酶,不要反复冻融。

电泳时间过长或过短。溴酚蓝达到分离胶的底部即应该关闭电泳电源。

缓冲溶液、SDS都要新鲜配制。

避免加样过多,提高分辨率。小体积样品可给出窄带,加样体积根据样品浓度和凝胶厚度灵活掌握。一般上样体积为10-15uL(即2-10ug蛋白质)。

加热变性后的蛋白质样品要放置到室温即电泳,不要久放,因为蛋白质的二硫键在高温下可能是会断开,但是暴露于空气中温度降低会重新形成二硫键,而且可能在过久放置过程中蛋白质可能会再折叠,更不要扔到冰箱里保存。

11.“鬼带”的出现及处理

“鬼带”就是在跑构象复杂的蛋白质大分子时,在泳道顶端出现一些未知条带或在加样孔底部生成沉淀,这主要是因为还原剂在加热的过程中被氧化失活,使解离的蛋白质分子重新折叠和亚基重新缔合,由于其分子量通常要比目标条带大,所以会生成未知条带或沉淀。

处理办法:在加热煮沸后,再添加适量的DTT或Beta巯基乙醇,以补充不足的还原剂;或可加适量EDTA来阻止还原剂的氧化。

12.拖尾现象

主要是样品溶解效果不佳或分离胶浓度过大引起的。

处理办法:加样前离心;选择适当的样品缓冲液,加适量样品促溶剂;电泳缓冲液时间过长,重新配制;降低凝胶浓度。

13.纹理现象

主要是样品不溶性颗粒引起的。

处理办法:加样前离心;加适量样品促溶剂。

14.溴酚蓝不能起到指示作用

我们在实验中有时会出现溴酚蓝已跑出板底,但蛋白质却还未跑下来的现象。

主要原因:缓冲液和分离胶的浓度过高。

处理办法:更换正确pH值的Buffer;降低分离胶的浓度。

15.甘氨酸在电极缓冲液中的作用

SDS-PAGE中样品液和浓缩胶选TRIS/HCL缓冲液,电极液选TRIS/甘氨酸,电泳开始后,HCL解离成氯离子,甘氨酸解离出少量的甘氨酸根离子。蛋白质带负电荷,因此一起向正极移动,其中氯离子最快,甘氨酸根离子最慢,蛋白居中。电泳开始时氯离子泳动率最大,超过蛋白,因此在后面形成低电导区,而电场强度与低电导区成反比,因而产生较高的电场强度,使蛋白和甘氨酸根离子迅速移动,形成以稳定的界面,使蛋白聚集在移动界面附近,浓缩成一中间层。

16.电泳电压很高但电流很低

现象:电压50v以上,可电流却在5mA以下。

主要原因:电泳槽没有正确装配,电流未形成通路。包括:内外槽装反;外槽液过少等。

处理办法:正确装配电泳槽即可。

17.如何提高SDS-PAGE电泳分辨率

使聚丙烯酰胺的充分聚合,可以提高凝胶的分辨率。

建议做法:待凝胶在室温凝固后,可在室温下放置一段时间使用。忌即配即用或冰箱放置,前者易导致凝固不充分,后者可导致SDS结晶。

18.电泳时间比正常要长

可能是因为凝胶缓冲系统和电级缓冲系统地PH选择错误,即缓冲系统地PH和被分离物质的等电点差别太小,或缓冲系统的离子强度太高。

19.配胶缓冲液系统在电泳中的影响

缓冲液在电泳过程中的主要作用是维持合适的pH。电泳时正极与负极都会发生电解反应,正极发生的是氧化反应,负极发生的是还原反应,长时间的电泳将使正极变酸,负极变碱。缓冲液可以维持溶液两极的pH保持基本不变。在浓缩胶中,pH环境呈弱酸性,因此甘氨酸解离很少,泳动效率低;而CL离子却很高,两者之间形成导电性较低的区带,蛋白分子就介于二者之间泳动并聚集到一起,浓缩为一狭窄的区带。所以,pH对整个反应体系的影响是至关重要的,实验中在排除其他因素之后仍不能很好解决问题的情况,应首要考虑该因素。







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