蛋白质组学

SILAC细胞培养实验技术原理

细胞培养稳定同位素标记技术(SILAC)是在细胞培养过程中,利用稳定同位素标记的氨基酸结合质谱技术,对蛋白表达进行定量分析的一种新技术。它不仅可以对蛋白质进行定性分析,还可通过质谱图上一对轻-重稳定同位素峰的比例来反映对应蛋白在不同状态下的表达水平,实现对蛋白质的定量。

SILAC的技术优势

1、SILAC不需要对肽段进行同位素标记;

2、因为标记氨基酸可以的渗入到细胞的蛋白中,所以不存在样品的标记效率问题;

3、因为蛋白质被均一的标记,所以蛋白中各个肽段都可以对蛋白进行定量,相互作证;

4、SILAC标记对细胞生长无影响:不影响细胞形态,不影响细胞对数生长期,不影响细胞分化;

5、肽段液相行为一致,可以共洗脱。

关于培养基的选择

由于SILAC技术是通过细胞培养进行稳定同位素标记,所以我们需要轻标培养基(lightmedium)和带有稳定同位素标记的重标培养基(heavy medium)。

轻标培养基就是我们平时培养细胞用的正常培养基,比如DMEM、MEM和1640。而正常培养基中去掉了精氨酸(Arg)和赖氨酸(Lys),换之以13C标记的精氨酸和赖氨酸,就成了重标培养基。

关于细胞培养

我们需要把细胞分成两部分,一部分使用轻标培养基培养,另一部分使用重标培养基培养,除此之外,其它操作步骤一致。

当然了,细胞经过6~7个倍增周期之后,用重标培养基培养的细胞中,稳定同位素标记的氨基酸就可以渗入到细胞新合成的蛋白中取代了原有氨基酸。建议当在这之后还需要进行标记效率检测,以标记效率符合SILAC技术要求。

关于寄送样品的量

1、SILAC定量蛋白质组学:若提供希望样品,收集细胞沉淀,PBS冲洗三遍,需要5 X106 或细胞沉淀不少于50 μL

2、SILAC修饰定量组学:相比于普通组学,修饰组学对蛋白需求量较大。需要5 X107 或细胞沉淀不少于500μL。磷酸化修饰定量送样量位2 X107 或细胞沉淀不少于200μL。





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