蛋白质组学

iTRAQ差异蛋白质组学质谱定量技术

iTRAQ差异蛋白质组学质谱定量技术-iTRAQ(isobaric Tagging for Relative and Absolute Quantitation)

技术简介:

研究不同生理和病理条件下细胞内蛋白质的含量和状态变化是比较蛋白质组学的核心内容.要揭示上述动态过程往往需要进行多个样品的同步比较分析.近年来,在体内和体外同位素标记基础上,用多维液相色谱分离多肽,进而用串联质谱进行相对定量的分析方法已成为高通量比较蛋白质组研究的主要手段之一.

iTRAQ (isobaric tags for relative and absolute quantitation)技术是由美国应用生物系统公司ABI 研发的一种多肽体外标记技术。该技术采用4种或8种同位素的标签,通过特异性标记多肽的氨基基团,尔后进行串联质谱分析,可同时比较4种或8种不同样品中蛋白质的相对含量或绝对含量。

技术优点:

1.   具有多种标记试剂,可同时对2-8个样品进行蛋白差异分析.

2.   该技术为体外标记,可标记各种动物组织、植物组织、微生物、血浆、体液、细胞培养物、等样本。

3. 和以凝胶为基础的定量方法比较,该技术不仅可发现胞浆蛋白,还有膜蛋白、核蛋白、胞外蛋白,并可检测出低丰度蛋白、强碱性蛋白、小于10KD或大于200KD的蛋白。

4.可标记修饰后的氨基酸,因此可对磷酸化蛋白等翻译后修饰蛋白进行定性定量研究。

5.报告离子的相对分子质量较低(113-121),低分子量区是质谱定性(质量确定)和定量(丰度比较)较为准确的区域,因此质谱检测更为灵敏可靠。

技术原理:(以下均以4标为例)


图1:iTRAQ 试剂结构

iTRAQ试剂由三部分组成:

报告基团(reporter group相对分子质量分别为114、115、116和117)

质量平衡基团(balance group相对分子质量分别为31、30、29 和28)

肽反应标记试剂基团(peptide reactive group)

形成4种相对分子质量均为145的等量异位标签。


图2:iTRAQ实验标记原理

iTRAQ试剂标记酶解后的肽段,可与氨基酸N端及赖氨酸侧链连接的胺标记同重元素(isobaric)。在质谱图中,任何一种iTRAQ试剂标记的不同样本中的同一蛋白质表现为相同的质荷比。


图3.iTRAQ实验二级质谱

在串联质谱中,报告基团、质量平衡基团和多肽反应基团之间的键断裂,质量平衡基团丢失,带不同同位素标签的同一多肽产生质量为114,115,116和117Da的报告离子,根据报告离子的丰度可获得样品间相同肽段的定量信息,再经过软件处理得到蛋白质的定量信息。







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