蛋白质组学

蛋白质组学样本提取指南

上一期我们总结归纳了蛋白质组学样本的收集与保存方法,大家学会了吗?我们辛辛苦苦准备的样本到了提取的时候不知道选择哪一种裂解液?选择好了裂解液又苦于找寻最佳的提取方式?提取好了又找不到适合的定量方法?那么这一期我们将继续分享蛋白质组学样本提取的知识,超实用干货,一起来学习吧~

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裂解液的选择

裂解液千千万万种,也无非是离液剂(助溶剂),表面活性剂,还原剂和蛋白酶抑制剂等的混合液,根据我们的实验目的可以选择不同的试剂去配制裂解液,下面我们来介绍一下这些试剂的特点:

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离液剂

我们常用的离液剂为尿素,它的主要作用是破坏氢键等次级结构,使蛋白的肽链伸展,将蛋白的疏水中心充分暴露出来,降低接近疏水残基的能量域,但值得注意的是当尿素与表面活性剂chaps联合使用的时候,会使某些蛋白质因吸附在固相pH梯度凝胶中而发生样品丢失,并且由于变性使蛋白质的疏水中心充分暴露,也导致了潜在的疏水键作用增强,因此尿素一般不单独使用,我们推荐尿素与硫脲联合使用,硫脲的使用改善了蛋白质的溶解性,在实际使用中我们经常将2 M硫脲与5-8 M尿素联合使用,以利于膜蛋白的提取。

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表面活性剂

离子型表面活性剂:包括十二烷基硫酸钠(SDS)、胆酸钠、脱氧胆酸钠等,其中SDS能有效的溶解膜蛋白,但当其浓度高于0.25%时会对等电聚焦产生影响。离子型表面活性剂使蛋白变性程度更高,蛋白以单体形式被分离,便于分子量的测量;

非离子型表面活性剂:包括TritonX-100、TritonX-114、NP-40、Tween-20等,阴离子表面活性剂对蛋白和蛋白间相互作用干扰较弱,而非离子型表面活性剂更适用于分离功能性的蛋白复合物;

两性离子型表面活性剂:包括chaps、Zwittergent3-14等,优点是既可以减少蛋白间相互作用的干扰,又不会使蛋白过度变性,常用于制备等电聚焦的样品。

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还原剂

功能是打开二硫键,使蛋白分子尽量从球状变成链状,增加蛋白质的溶解性,以及暴露出尽可能多的酶切位点,因此在制备蛋白样品时通常会加入还原剂,常用的还原剂有β-巯基乙醇(0.07%)、二硫苏糖醇(65 mM)、TCEP等。

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蛋白酶抑制剂

包括PMSF、EDTA、AEBSF等,加入不同抑制剂时要注意裂解液的PH值以及使用浓度,或者选择更为方便的商品化混合型蛋白酶抑制剂。

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蛋白的提取

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充分的破碎样本

上述几种为常用的破碎方法,各有优缺点,例如物理方法的优点是操作简单、省时省力,但是破碎的样本类型有局限性,破碎某些样本时会不够充分;化学处理法只加入裂解液也往往达不到令人满意的效果。因此我们在提取时常常结合多种破碎方法,比如先液氮研磨,再加入比较强的变性剂配以机械匀浆的方法,提取效果十分不错哦!

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常规样本的蛋白质提取方法

动物组织液氮研磨/匀浆/组织破碎仪→加入裂解液震荡→冰上静置20 min→4℃离心取上清;动物细胞细胞沉淀加入裂解液超声破碎细胞,超声可以断裂DNA降低样本粘稠度→冰上静置20 min→4℃离心取上清;植物组织液氮研磨/匀浆/组织破碎仪→加入裂解液震荡→冰上静置20 min→4℃离心取上清→上清加入预冷的丙酮或TCA-丙酮沉淀蛋白、洗去色素→挥干残留液体→裂解液复溶蛋白粉末;微生物真菌、细胞壁较厚的细菌,如革兰氏阳性菌,可以采取研磨的方式破碎细胞壁,其他菌体可用超声破碎的方式提取→冰上静置20 min→4℃离心取上清;
体液

常规的体液样本一般只需离心或者过滤去除杂质即可用于组学实验,例如尿液、唾液等,但是血清/血浆样本中含有许多高丰度蛋白,而质谱是一种离子饱和性检测器,低丰度离子的信号很容易被高丰度的抑制,从而无法检测到,因此血清/血浆样本通常需要去除高丰度蛋白,商品化的试剂盒或者色谱柱都是不错的选择;

Tips:提取好的蛋白上清液建议分装几份,避免反复冻融;当样本特别少的时候尽量减少提取步骤,以免过多损失样本。

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提取质量检测

通过SDS-PAGE凝胶检测蛋白提取质量,是否有污染,定量准确性以及是否存在高丰度蛋白。

A:正常胶图,条带清晰、无弥散、同组样本重复性好;B:同组样本个体差异大,建议重提;

C:条带少,需要优化提取方法,例如单一的破碎方法改为多种破碎方法联合使用、选用裂解能力能强的裂解液等;

D:出现横纵条纹,解决方法为样本再次离心去除杂质,样本除盐和更换电泳缓冲液等;

E:定量不准确,建议重新定量;

F:某一条或几条条带含量超过或达到总蛋白量的50%时,即存在高丰度蛋白,如果没有特定的去除高丰度蛋白,样本的鉴定数目相对来说会少一些。

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蛋白定量







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