蛋白质组学

抗体从头测序简述

网上搜索“抗体从头测序”,搜索结果会展示一长串的资源和服务。关于该技术的描述太多了,有很多描述都大同小异。小编想借此文给大家说说我们为什么需要抗体从头测序以及如何进行抗体从头测序。

抗体从头测序的分类

抗体从头测序是根据抗体样品种类进行区分的。我们通常根据抗体的“克隆性”( clonality)来描述抗体样品。克隆性是指样品中存在的不同抗体序列或遗传系谱的数量。

单克隆:样品中包含具有相同序列的抗体。单克隆性是进行抗体从头测序的前提条件。在极少数情况下,可以对单抗的简单混合物进行蛋白质组测序,但不一定能够保证成功。

多克隆:样品中包含具有不同序列的抗体,定量范围通常较大。如来源于血清的抗体被表征为多克隆抗体。

寡克隆:样品包含数量有限的抗体系谱,由决定簇互补区(complementarity determining regions, CDRs)所定义。

由上述抗体分类出发,抗体从头测序分为单克隆抗体从头测序、多克隆抗体从头测序和寡克隆抗体从头测序。本文主要针对单克隆抗体从头测序进行阐述。

为什么需要抗体从头测序?

复原单克隆抗体重链和轻链序列的通用方法有两种。最直接的方法是对B细胞的转录子或遗传物质进行测序。该方法适用于杂交瘤,噬菌体展示,酵母菌展示或单细胞筛选,是抗体测序法中最具成本效益和最可靠的方法。但是,源细胞并不一定总是可用的。如果杂交瘤丢失,就可能无法获得遗传物质。在这种情况下,可以使用抗体测序来复原抗体序列,例如使用Edman降解或质谱分析技术。

基于Edman降解法的测序

Edman降解法,也称为埃德曼测序法,是一种成熟的蛋白质序列测定技术,该技术从N端开始,一次读取一个氨基酸。Edman降解法测序的主要优势是样品量要求低(通常需要少于1 ug)。 Edman降解法测序的质量随着氨基酸加工数量的增加而降低,因此该测序发通常用于确定前30-50个氨基酸,很少用于抗体全序列测定。

基于质谱的抗体测序法

质谱法已成为抗体全序列测定的首选方法。在几乎所有用于抗体测序的质谱方案中,都会先将抗体分解成15-20个氨基酸长的肽,然后在质谱仪中进行分析。在理想情况下,每种肽都可产生片段图谱。进行抗体从头测序时,需要对每个片段图谱进行解析并揭示抗体的一部分序列。通常,我们用具有不同切割基序的多种酶来分解抗体,从而确保抗体的每个区域均可产生几个重叠肽。如图1所示,通过产出重叠肽,抗体测序技术可以以类似于鸟枪法测序组装基因组的方式重组抗体序列。

肽谱分析和抗体从头测序

在此,我们有必要将肽谱分析和抗体从头测序进行区分。肽谱分析的目标是确认已知序列,抗体从头测序是从片段图谱或图谱集合中获得之前未知序列的过程。与抗体从头测序相比,肽谱分析需要的酶解次数和质谱运行次数往往更少,这就意味着花费可以更低。

图1.抗体从头测序过程。首先,用多种酶将抗体样品进行分解。每种酶都有不同的切割模式(以不同颜色表示),且每种酶都不会给抗体序列产生新的肽。抗体从头测序利用从多个酶分解物中产生的重叠肽来实现抗体的完全覆盖,并确保当中没有遗漏任何一个序列。

那么单克隆抗体测序优势有哪些呢?以百泰派克的单克隆抗体从头测序技术为例进行概括:

1、可实现抗体分子轻重链100%全序列的拼接;

2、结合PEAKS等质谱分析软件,制定了有针对性的数据处理算法,不遗漏任何有效数据信息;

3、可对多种亚型和不同类型的抗体进行测序

4、有严谨的序列预测和严格的序列验证机制,只提供完全匹配的结果。







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