蛋白质组学

蛋白质测序中的氨基酸分离与定量

蛋白质测序是确定或部分蛋白质或肽的氨基酸序列的实际操作程序。蛋白质测序也可以用来鉴定蛋白质或表征其翻译后修饰。通常情况下,蛋白质的部分测序就可以提供足够的鉴定信息(一个或多个序列标签)。

蛋白质测序的两种主要直接方法是质谱法和使用蛋白质测序仪(测序仪)进行的Edman降解法测序。目前使用最广的蛋白质测序和鉴定方法是质谱法,而Edman降解则是表征蛋白质N端最重要的方法之一。

确定蛋白质的氨基酸组成

通常我们希望能在找到有序序列之前先知道蛋白质的氨基酸组成,这有助于我们发现测序过程中的错误并修正最终结果。了解蛋白样品中氨基酸的组成,可协助判断哪种蛋白酶才适用于该蛋白质的水解,此外还可以确定蛋白质中低水平非标准氨基酸(例如正亮氨酸)的掺入错误。确定氨基酸组成的通用方法通常被称为氨基酸分析:

1. 将已知数量的蛋白质水解成其组成成分氨基酸;

2. 以合适的方式分离并定量氨基酸。

蛋白质水解

通过将蛋白质样品在6 M盐酸中加热到100–110 °C,并保持该温度 24小时或更长时间来完成水解,有许多庞大的疏水基团的蛋白质可能需要更长的加热时间。但是,因为这些反应条件非常剧烈,以至于某些氨基酸(丝氨酸,苏氨酸,酪氨酸,色氨酸,谷氨酰胺和半胱氨酸)会发生降解。为解决此问题,Biochemistry Online建议可以通过给不同的样品加热不同的时间,分析每种生成的溶液,并推测零水解时间。Rastall建议使用各种能够防止或减少降解的试剂,例如硫醇试剂或苯酚,以保护色氨酸和酪氨酸不受氯的侵蚀,并预氧化半胱氨酸。他还建议通过测量氨的释放量来确定酰胺水解的程度。

氨基酸分离与定量

可以通过离子交换色谱法分离氨基酸,然后进行衍生化来帮助检测。更常见的方法是将氨基酸进行衍生,然后通过反相HPLC来解决。

以NTRC提供的离子交换色谱法为例:使用磺化聚苯乙烯作为基质,将氨基酸加入酸溶液中,用逐渐增加pH的缓冲液冲洗柱子。当pH达到其各自的等电点时,氨基酸被洗脱。一旦氨基酸被分离,就加入可形成有色衍生物的试剂即可确定各氨基酸的量。如果氨基酸的量超过10 nmol,可以使用茚三酮;与脯氨酸反应时为黄色,与其他氨基酸反应时为鲜紫色。氨基酸的浓度与所得溶液的吸光度成正比。只需要少量(低至10 pmol)该溶液,就可用邻苯二甲醛(OPA)或荧光胺等试剂形成荧光衍生物。柱前衍生化可使用Edman试剂来产出能被紫外光检测到的衍生物,使用能产出荧光衍生物的试剂可获得更高的灵敏度。衍生的氨基酸通常使用C8或C18硅胶柱和优化的洗脱梯度进行反相色谱分析。使用UV或荧光检测器检测洗脱的氨基酸,并将峰面积与衍生标准品的峰面积进行比较,便可以完成对每种氨基酸的定量分析。

本文由百泰派克生物整理编辑。

百泰派克专注于质谱技术,主要提供蛋白质理化性质分析及结构解析、以质谱技术为基础的蛋白质组学代谢组学技术服务。公司致力于建立国际领先的蛋白质研究分析技术平台,为各科研院所和大学提供高效、准确、性价比高的蛋白质(组)研究技术包裹,协助客户在基础研究、分子诊断及其他生命科学研究领域取得突破,为生命科学的发展做出贡献。







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