蛋白质组学

Edman降解的具体步骤

Edman降解是蛋白质测序中一个非常重要的反应步骤,因为通过该反应可以对蛋白质有序的氨基酸组成进行分析。自动化Edman测序仪现在已得到广泛使用,他们能够对长约50个氨基酸的肽进行测序。以下概括了使用Edman降解进行蛋白质测序的步骤,随后还将对其中一些重要步骤做详细说明。

1. 用2-巯基乙醇等还原剂破坏蛋白质中的任意二硫键,过程中可能需要一个保护基团(例如碘乙酸)以防止化学键重新形成;

2. 果蛋白质不止一个,则需要分离并纯化蛋白质混合物中的各条肽链;

3. 确定每条链中的氨基酸组成;

4. 确定每条链末端的氨基酸;

5. 将每条链断裂成50个氨基酸以下的片段;

6. 分离并纯化肽片段;

7. 确定每个肽片段的序列;

8. 使用其他裂解方式重复以上步骤;

9. 构建整条蛋白质序列。

 

Edman测序实验流程图(百泰派克)

蛋白质裂解成肽片段的过程

长度超过50-70个氨基酸的肽不能通过Edman降解来进行蛋白质测序。因此,需要将长蛋白链裂解成小片段,然后再进行单独测序。裂解过程可以通过内肽酶(例如胰蛋白酶或胃蛋白酶)进行,也可以通过化学试剂(例如溴化氰)进行。不同的酶具有不同的切割模式,片段之间的重叠可用于构建整体蛋白质序列。

Edman反应过程

将待测序的蛋白质吸附到固体表面上。常见的一种基材是涂有聚丁二烯(一种阳离子聚合物)的玻璃纤维。将Edman试剂苯基异硫氰酸酯(PITC)与12%三甲胺的弱碱性缓冲溶液一起添加到吸附的蛋白质中,将所得物与氨基酸N端的胺基进行反应。

然后通过添加无水酸来选择性地分离末端氨基酸。接着,该衍生物异构化,得到替代物苯基硫代乙内酰脲。洗掉该替代物并通过色谱法鉴定,重复整个循环。每个步骤的效率约为98%,能有效地鉴定约50个氨基酸。

蛋白质测序仪的使用

蛋白质测序仪是一种以自动化方式执行Edman降解的机器。将蛋白质或肽的样品固定在蛋白质测序仪的反应容器中,进行Edman降解。每个循环从蛋白质或肽的N端释放并衍生一个氨基酸,然后通过HPLC鉴定生成的氨基酸衍生物。对整个多肽重复进行测序过程,直到测定了完整的可测量序列或提前设定的循环次数为止。







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