蛋白质组学

基于MS强度或计数的数据依赖法非标记定量蛋白质组学的蛋白质互作分析(三)

虽然基于MS1的方法通常可提供相对准确且快速的定量,但该技术还是存在许多问题。首先,当“已鉴定”的化合物不用于目标数据提取时,跨多个样本的不同MS1 LC峰的对齐需要很复杂的算法。此外,当从复杂样品中提取所有测量的MS1质量时,样品之间光谱峰重叠的可能性增大,从而在光谱和LC级别上产生卷积数据。其次,样本复杂度,检测装置的特异性以及MS1扫描对LC峰取样的次数控制了检测极限(通过引入一种不能从母体离子信号中分离出来的噪声水平)。高分辨率质谱法可用于减少这种影响,但是仅通过分辨率就可以分离出的物质是有限的。斯宾格勒等人发现分辨率可以鉴定肽元素的组成,但许多肽都具有相似的化学组成,因此需要用到正交技术来分离化合物。以上这些因素再加上限制进入检测系统的离子数量的技术,例如自动增益控制(AGC),可能导致所有样品都检测不到化合物,或者低强度离子的误差超过可接受范围。

实验方法的改进可用于缓解这些问题。样品分馏是其中一种较为常见的方法,即阳离子交换分离,或使用长柱长液相色谱梯度。这些方法的目的都是要尽可能减少LC-MS峰内的干扰,从而能够更准确地测量样品的肽含量。然而,如果使用多维碎片化,通常需要在多个部分中鉴定同一种物质,这使得定量变得更加复杂。这个问题可以通过软件进行纠正,但分离无标签样品仍然是一个具有挑战性的问题。这就是说,由于样本复杂度算不上大问题,且已经被应用于区分到底是真正的相互作用还是背景噪音,通常可以在单个LC-MS/MS分析中对AP样本进行MS1量化。

所有依赖于DDA(同位素和LabelFree)的方法都有同样的问题——由于DDA方法的随机性,注入样品的采样不足。在DDA实验中,很难确定峰面积的缺失是由于化合物的缺失还是与检测的随机性有关,这增加了系统内测量的可变性,降低了最接近检测极限的测量的置信度。由于蛋白质互作研究通常涉及混合物中所有丰度水平的蛋白质(取决于它们与正在纯化的“诱饵”蛋白质的相对关联),这种随机性限制了可实现的网络覆盖量。不同的定量方法可以降低分析过程受到采样的影响,以特定化合物为目标,并使用MS/MS作为手段来提高检测的选择性和特异性,这些方法将在下期文章中进行介绍。

非标记定量蛋白质组Label-free定量蛋白组学一般操作流程(图片百泰派克生物科技)

本文由百泰派克生物科技整理编辑。

百泰派克生物科技专注于基于质谱的蛋白质组学服务,结合亲和纯化与非标记定量蛋白质组Label-free、SILAC或SWATH定量技术服务,开发了一系列蛋白质组研究策略,其灵敏度高、重复性好,非常适合蛋白质相互作用的研究。

文献参考:Stephen Tate, Brett Larsen, Ron Bonner, Anne-Claude Gingras, Label-free quantitative proteomics trends for protein-protein interactions. Journal of Proteomics, 2013.







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