蛋白质组学

基于MS强度或计数的数据依赖法非标记定量蛋白质组学的蛋白质互作分析(一)

上期文章我们介绍了运用非标记定量蛋白质组LabelFree技术研究蛋白互作的背景,接下来我们将分几期,陆续给大家介绍具体的研究方法。本期要介绍到的是基于MS强度或计数的数据依赖法非标记定量蛋白质组学的蛋白质互作分析。

在试验中使用不同的同位素标记(某些情况下等压标记)是一种行之有效的肽和蛋白质定量方法。通常,分析之前,标记样品和未标记样品是混合在一起的,这时可以通过测量相应的峰值强度来直接确定化合物比率。标记大致可以分成这些共价附着在肽上的标记,包括同位素编码的亲和标签、ICAT或iTRAQ、通过酶反应合成(例如通过胰蛋白酶合成18O)或通过代谢合成(例如在细胞培养中用氨基酸标记稳定同位素)、SILAC等。在蛋白质互作的背景下,标记法通常用于识别非特异性结合的蛋白,也适用于监测调节相互作用。总之,基于同位素标记的技术可获得非常好的分析结果,但由于分析时间长以及按比例缩放到与样本合适的大小的问题等因素限制了此类技术的应用。

非标记定量蛋白质组LabelFree定量法对所采用的分析方法有不同的要求。从概念上讲,光谱计数是最简单的非标记定量蛋白质组LabelFree分析方法。在鉴定实验(鸟枪实验)中,单个肽触发的MS/MS事件的数量可以合计为图谱数,可以在肽和蛋白质水平上制成表格。最终,通过比较不同样品中与该蛋白质相关的所有肽的光谱计数来比较样品中蛋白质的相对丰度。 在蛋白质与蛋白质互作研究中,光谱计数和相关的方法主要用于区分真正的相互作用和非特异性结合蛋白,或者确定不同蛋白质与蛋白质互作的主要差异。 

非标记定量蛋白质LabelFree法一般操作流程(图片百泰派克生物科技)

为了提供可靠的信息,计数方法需要一种能够在高频下采样LC峰的仪器,仪器越快,光谱计数数据的质量就越高。光谱计数方法也很大程度上受到捕获方法的影响,特别是那些通过优化来限制单个肽的MS/MS事件数的方法。最后,由于对峰进行了多次取样,鉴定动态范围受到限制,低水平离子可能优先于高强度离子而丢失,从而限制了光谱计数在中等丰度到高丰度蛋白质或丰度于样品之间不断变化的蛋白质中的应用。因此,计数方法并不总适用于多种重要的动态调节相互作用。

本文由百泰派克生物科技整理编辑。

百泰派克生物科技专注于基于质谱的蛋白质组学服务,结合亲和纯化与非标记定量蛋白质组LabelFree、SILAC或SWATH定量技术,开发了一系列蛋白质组研究策略,其灵敏度高、重复性好,非常适合蛋白质相互作用的研究。

文献参考:Stephen Tate, Brett Larsen, Ron Bonner, Anne-Claude Gingras, Label-free quantitative proteomics trends for protein-protein interactions. Journal of Proteomics, 2013.







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