蛋白质组学

蛋白多肽类药物药代动力学分析方法研究进展

[摘要]随着生物技术的发展,近年来可用于临床的蛋白多肽类药物日益增多,且已成为治疗众多疾病的首选药物。蛋白多肽类药物在药代动力学方面仍有许多问题需要解决,该类药物的吸收、分布、代谢、排泄过程与小分子药物不同,各种内源性蛋白的干扰也对该类药物的分析造成影响。综述蛋白多肽类药物药代动力学分析方法研究进展,重点介绍同位素标记示踪法、活体成像技术、免疫分析法、色谱法等方法的特点及其在蛋白质多肽类药物中的应用。

    蛋白多肽类药物具有特异性高、用药剂量低、生理活性强、毒副作用小等特点,可用于肿瘤、心血管疾病等多种病症的治疗。近年来,随着医学和生化技术的发展,越来越多的蛋白多肽类药物已上市,且已成为临床治疗众多疾病的首选药物,因此,开展蛋白多肽类药物的相关研究具有重要意义。

    药代动力学(简称药动学)是药物研究中不可或缺的组成部分,而蛋白多肽类药物在体内的吸收、分布、代谢和排泄(ADME)过程往往与小分子药物不同,这使得该类药物的药动学分析方法与传统药物存在区别,增加了其检测难度。笔者所在课题组曾发表蛋白多肽类药物体内药动学特征及分析方法的相关论述。近年来,该类药物的药动学研究又有了诸多突破性进展。本文从药物研究策略和开发方面简述蛋白多肽类药物的ADME 机制及药动学/药效学(pharmacokinetics/pharmacodynamics,PK/PD)模型在人体药动学预测中的应用,重点介绍该类药物传统分析策略的技术发展及新型检测方法的应用,希望能为相关研究人员提供一些参考。

1、蛋白多肽类药物的药动学特点及模型

1.1 吸收

    蛋白多肽类药物大多体内稳定性差且难以通过生理屏障,因此多采用非胃肠道途径给药,目前已上市的多肽类药物中61% 通过注射方式给药 。但在临床应用中,该给药途径存在耐受性不佳、需要频繁注射等缺点,故开发更为合理的新制剂及给药途径是提升蛋白多肽药物体内吸收的必然趋势。缓释注射剂可以改变药物转运过程,延长体内吸收及作用时间。结合聚乳酸羟基乙酸长效微球是最为成功的蛋白多肽缓释注射剂制备方法,如Ferring 公司的曲普瑞林注射剂(Decapeptyl)以PLGA为骨架,在体内可以持续释药1 个月 。还有研究者提出无需预处理的即用型缓释注射剂,如Apide 公司研发的含有己基侧链的亲脂性聚乳酸(polylactice acid,PLA)微球,其在常温下不需有机溶剂即可结合多肽药物,避免了混悬的前处理过程,使用该技术的曲普瑞林注射剂在大鼠体内释药期可达6 个月 。

    口服蛋白多肽类药物的开发是国内外研究的热点,其可以降低用药次数、延长有效血药浓度时间,适用于长期用药。该类药物研发的瓶颈在于蛋白多肽在吸收过程中易受胃肠道蛋白酶降解,且对肠道黏膜的通透性低,这使得其直接口服的生物利用度不足2%。结合纳米粒等载体及加入酶抑制剂均可以增强蛋白多肽类药物的口服吸收,提高其生物利用度。如Chuang 等 利用钙离子螯合剂乙二醇二乙醚二胺四乙酸(ethyleneglycol tetraaceticacid,EGTA)作为蛋白酶抑制剂,使口服胰岛素的生物利用度达到21%。Castro 等  还提出使用聚乙烯吡咯烷酮(polyvinyl pyrrolidone,PVP)等多聚物成膜材料,将蛋白多肽药物制成口腔膜剂,同样可以延长药物酶解过程,增加其生物利用度。细胞穿透肽(cell penetrating peptides,CPPs)是具有细胞膜穿透作用的短肽,可促进蛋白多肽的肠道黏膜透过性。如Penetratin(天然CPPs)能显著提高口服胰岛素的肠道吸收。还有研究发现,Penetratin 的促吸收作用存在区域选择型,如L-Penetratin 与D-Penetratin 分别在回肠、结肠中具有最强的促胰岛素吸收能力。

1.2 分布

    由于具有极性强以及相对分子质量较大的特点,蛋白多肽类药物的组织分布过程缓慢,游离药物主要通过细胞旁路中的血液-组织液对流以及细胞内吞方式分布到外周组织。同时,该类药物的跨膜渗透性低,大多被限制在血浆及组织间隙中,影响药物的表观分布容积(Vd)。如单抗静脉注射后Vd 与血浆体积相近,组织与血液的药物浓度的比值约为1%~10% 。值得注意的是,传统的稳态表观分布容积(Vdss)计算模型假设药物在消除部位及循环系统的浓度可迅速达到平衡,即主要在中央室消除,而大分子药物的消除多发生在外周组织。因此,对于具有复杂药动学过程(如靶点介导的组织结合)的蛋白多肽类药物,采用生理药动学(physiologically basedpharmacokinetic,PBPK) 模型及靶点介导的药物处置(target-mediated drugdisposition,TMDD)模型可以更准确地描述药物的体内过程,并评估其组织分布。

    蛋白多肽的内吞分布机制包括细胞吞噬及受体介导的内吞作用。其中受体介导的内吞是蛋白多肽分布至细胞的主要方式,该过程中药物与受体的结合程度对药物靶细胞分布尤为重要,有研究者利用相关受体作为靶标筛选药物。如转铁蛋白受体(TfR)在肿瘤细胞中高表达,Dai 等  使用噬菌体展示技术,筛选出与TfR结合的多肽BP9,该多肽对高表达TfR 的肿瘤细胞的增殖有显著抑制作用。

    以trastuzumab emtansine 为代表的抗体药物偶联物(antibody drug conjugate,ADC)是目前抗体领域的研究热点,其由单抗与细胞毒素偶联结合构成。从其结构上看,抗体相对分子质量约占ADC 药物的98%,因此,ADC 整体药物的体内分布主要取决于裸抗体。细胞毒素的分布过程则通过ADC 药物在靶细胞溶酶体中的逐步释放实现,抗体作为ADC 中的载药系统,其自身的分布过程可能会影响细胞毒素的体内分布。因此,精确测定药物不同部分在血液、组织及靶点的浓度是ADC药物体内药动学研究的必要步骤。此外,细胞毒素的数量也会影响ADC 药动学特性,如提高药物抗体比(drugto antibody ratio,DAR)会使药物清除率升高,半衰期缩短,结合过多的细胞毒素还会导致免疫系统启动清除机制。因此,ADC 药物的DAR 常以2~4 为最佳范围。

1.3 代谢

    蛋白多肽类药物通过细胞内蛋白酶降解进行消除,其主要消除途径包括Fc 受体介导的消除和靶点介导的消除。

1.3.1 Fc 受体介导的消除

    Fc 受体介导的消除具有非特异性,含有Fc 结构的蛋白多肽均可通过IgG 结合细胞表面的Fcγ 受体,并被内吞进入细胞进行酶解。需要注意的是,内源性IgG 的浓度远大于药物的临床剂量,因此该药物消除途径不会引起Fc 受体饱和,具有线性药动学特征。与上述过程不同,通过吞噬作用进入细胞的蛋白药物,可以在内涵体的弱酸性环境下通过IgG结合新生儿Fc 受体 ( neonatal Fc receptor,FcRn) 而免受降解 。随后IgG-FcRn 复合体被转运至细胞表面,在生理pH 下释放药物。FcRn 对蛋白多肽的保护可以显著延长药物的半衰期,其关键在于IgG与FcRn 的结合程度。有研究者尝试使用生物膜干涉技术(BLI)测定IgG-FcRn 的亲和力,由此推算出单抗药物的体内半衰期与临床数据有较高相关性(R2 = 0.963)。

1.3.2 靶点介导的消除

    靶点介导的消除(target-mediatedclearance,TMC)是特异性消除途径,包括细胞表面受体介导的内吞消除和可溶性靶点介导的免疫复合物形成。蛋白多肽药物可以与靶细胞表面受体结合并被内吞进入细胞,在溶酶体中被降解成为氨基酸及肽段。但细胞表面的靶点数量通常有限,因此TMC 具有可饱和性并使药物的药动学特征呈非线性。如西妥昔单抗(cetuximab)是表皮生长因子受体(epidermal growthfactorreceptor,EGFR)的靶向药物,在低剂量临床试验中,西妥昔单抗的药物清除率会随其剂量上升而降低。可溶性靶点则通过与药物结合形成免疫复合物,进而通过细胞吞噬的方式介导消除。但体内的可溶性靶点数量有限,因此该途径不作为主要的蛋白多肽药物消除方式。有研究发现,某些蛋白多肽药物还可通过脱靶效应非特异性地结合非靶点部位,加快靶向药物的消除。如人源化的抗Aβ 抗体可以结合猴纤维蛋白原,其在食蟹猴中的清除率较高。因此,在靶向药物筛选中,可采用蛋白芯片等技术验证药物-靶点的结合。

    抗药抗体(anti-drug antibodies, ADA)的中和作用是蛋白多肽药物的另一种重要消除机制,药物的免疫原性可以刺激机体产生ADA,药物与ADA 结合形成的复合物被免疫系统清除,中和药效并增加药物清除速率,也会使药物药动学特征呈非线性。

1.4 排泄

    蛋白多肽类药物主要通过肾脏排泄。一般认为相对分子质量小于300 000 的蛋白可以从肾小球滤过,并在肾小管被上皮细胞从管腔中重吸收进行酶解。但多数蛋白多肽的相对分子质量较大,限制了药物以原型药形式在肾脏排泄。因此,蛋白多肽类药物的体内快速消除主要通过细胞内酶解实现,而非药物排泄过程。例如,甘氨酸延伸型胃泌素17 在人体内半衰期为4~7min,而其肾清除率仅为0.016 mL · min–1。

    在蛋白多肽类药物研发过程中,通过聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)修饰等方式改造原型药是常用方法。PEG 在整体药物中可以保护活性片段不受酶解,其增加的相对分子质量也会限制肾排泄过程,提高药物在循环中的稳定性。如多肽EILDVP(Glu-Ile-Leu-Asp-Val-Pro)被相对分子质量为20 000 的直链甲氧基聚乙二醇(mPEG20 000)修饰后,在小鼠体内的清除率降低为原值的1/25 。

1.5 药动学/药效学模型

    在蛋白多肽类药物的研发过程中,建立合适的PK/PD 模型在确定给药方案、设计治疗模式等方面均具有优势,对新药开发及临床研究起指导作用。美国FDA在2004 年发表的新药关键路径白皮书中就提出“采取基于模型的药物研发策略”,将研究数据进行整合与关联,选取合适的PK/PD 模型以加快新药开发。目前,除传统的房室PK/PD 模型外,TMDD 模型和PBPK 模型也逐渐用于蛋白多肽类药物PK/PD 研究 。

    药物在各种属间的药动学过程存在差异性,可以通过PK/PD 模型由临床前数据预测蛋白多肽药物的人体药动学,决定药物的人类首次(FIH)药物试验剂量 。异率放大法常用于预测小分子药物药动学参数,其通过经验式对动物的生理及药动学数据进行简单拟合,但无法描述蛋白多肽药物的非线性TMDD 消除过程,因此准确度不足。如Dong 等通过异率放大法由猕猴的数据推测抗体临床药动学参数,预测的Cmax 值是实际数据的5.3 倍。TMDD 模型中引入药物-靶点结合物结合及解离常数(Koff 与Kon)等参数,描述药物与靶点的交互作用,可以从药物结合机制水平解释蛋白多肽药物的非线性TMDD 消除。同时,针对该类药物中药物-靶点结合物形成速率远大于解离速率的特性,可通过假设法简化模型以获得更稳定的数据;Singh等选取具有非线性药动学特征的单抗,建立使用快速结合假说的TMDD-PK/PD 模型,假设单抗与靶点结合以及药物-靶点结合物的解离迅速达到平衡,并使用平衡常数KD(KD = Koff / Kon)代替Koff 与Kon,PD 部分则采用细胞分布模型描述肿瘤生长过程,依据该PK/PD 模型准确预测了检验抗体的Vc 及Kel。

    PBPK 模型是目前蛋白多肽药物人体药动学预测的主要方法,其以生理、生化及解剖数据为基础,通过模拟机体的血液循环将药物处置相关的组织器官相互连接,各房室均代表一种组织或器官。使用该模型预测大分子药物人体药动学具有以下优点:1)可以预测药物在靶组织的浓度,从靶点水平描述药物暴露剂量与药效的关系; 2)考虑到不同病理生理条件,并定量描述其对药物处置的影响;3)将各组织器官看做单独隔室并相互连接,可以包含药物的多种PK 及PD 过程,如在淋巴液中的对流及FcRn 结合等。但实际应用中建立整体的PB/PK 模型相当复杂且需要大量的数据,近年又发展出Hybrid-PB/PK 及Minimal-PB/PK 模型。Minimal-PB/PK 模型对PB/PK 模型进行大幅简化,其将机体分为血液、淋巴液和组织,并依据药物对流机制将其相互连接,组织内的器官又按血管内皮紧密程度归为两类(Vtight 及Vleaky)且可分别描述药动学行为。当受试者仅能提供血药浓度数据时,该模型预测抗体的人体药动学数据较房室模型的准确度更高。PK/PD 在人体药动学预测上的优势使其还可用于推算FIH 剂量。最低预期生物剂量法(minimalanticipatedbiological level,MABEL)是欧洲药品管理局(EMA)于2007 年引入的FIH 剂量预测法,已有报道将PK/PD模型应用于蛋白多肽类药物的MABEL 计算 。

2、蛋白多肽类药物药动学分析方法

    蛋白多肽类药物在进行药动学研究的过程中受到诸多因素的制约,主要原因是该类药物的用药剂量小、血药浓度低且易受内源性物质干扰,这就要求在研究过程中选择灵敏度高且专属性强的分析方法。现代科技的飞速发展为蛋白多肽类药物的药动学研究提供了多种分析手段,可根据具体情况进行选择。

2.1 同位素标记示踪法

    同位素标记示踪法包括放射性同位素示踪技术与稳定性同位素示踪技术。稳定性同位素示踪技术利用普通同位素与稳定性同位素的质量差进行测定,可用于人体代谢动力学研究。如Zhou 等  根据前体-产物原则,以血液中游离苯丙氨酸丰度为前体池,通过输注L- -苯丙氨酸对人血清蛋白代谢进行分析。而放射性同位素示踪法是分析蛋白多肽类药物的经典方法,具有应用范围广且简捷直观的特点,尤其适合对其组织分布与排泄的研究。目前,FDA 已将放射同位素法测定的药动学数据作为药物安全性评价的有效依据。但因具有放射性污染的特性,限制了该方法在临床药动学研究中的应用。

    蛋白多肽药物的体内代谢是其药动学研究的难点,这主要是由于该类药物的代谢途径复杂,且代谢片段会进入体内氨基酸库,干扰分析过程。同位素示踪法具有直接测定过程稳定、检测限极低及前处理过程简单的特点,有望成为研究蛋白多肽药物代谢及体内处置的有力工具。放射性同位素标记法是回收体内药物代谢物的理想方法,通常将三氯醋酸(TCA)沉淀法、HPLC 等方法与同位素示踪法联用,按照相对分子质量及保留时间对代谢物进行分离确证。如廖建民等 采用125I 标记甲状旁腺素rhPTH(1~34) 以测定药物在大鼠体内血药浓度,并通过HPLC 图谱中保留时间判定代谢物峰。此外,同位素示踪法可以结合质谱,根据药物代谢特性及代谢物确证结果分析代谢产物结构,并结合药物已知的ADME 特性推测体内代谢途径,目前常用的是HPLC-RAM/MS 技术。

2.2 活体成像技术

    活体成像技术是指应用多种成像手段,对活体状态下的生物行为进行组织及细胞水平研究的分析方法。该技术在药物的组织分布研究上有显著优势,能够使药物的体内分布过程可视化,实时、动态地检测药动学过程,还可以非侵入性的在同一实验体连续获得数据,减小个体差异。目前常用于蛋白多肽药动学分析的活体成像技术有核素成像(PET/SPECT)及荧光标记技术。ter Weele 等  采用89Zr 标记间皮素抗体(AMA),通过PET 定量检测药物在荷瘤小鼠内的分布,结果显示,89Zr-AMA 在给药后6 天内逐渐聚集于肿瘤部位,在血液及各组织器官中的分布则持续降低;还使用近红外荧光染料IRDye 800CW 标记AMA 验证药物的微观动力学分布,通过肿瘤/ 背景比值(TBR)证明AMA 可有效分布于肿瘤细胞的细胞质。

    结合多种技术的成像模式(如PET/CT)是活体成像的发展方向之一,其可以同时获得功能显像与解剖结构信息,用于临床治疗方案的改善。贝伐单抗(bevacizumab)属于血管内皮生长因子抑制剂,而整合素在肿瘤新生血管的内皮细胞中高表达。Minamimoto 等  使用18F 标记靶向整合素αvβ3 的RGD(Arg-Gly-Asp)多肽FPPRGD2,作为PET/CT 的示踪剂注入肿瘤患者体内,通过比较患者接受贝伐单抗治疗前后18F-FPPRGD2 的组织分布,为预测药物治疗的预后效果提供依据。

2.3 免疫分析法

2.3.1 酶联免疫吸附测定

    酶联免疫吸附测定(ELISA)是目前蛋白多肽类药物药动学研究普遍采用的方法,具有特异性好、操作简单快速及可进行高通量检测的优点,尤其适合进行临床药动学研究,并受到药物监管机构的认可及推荐。数据显示,上市的95% 蛋白多肽药物在药动学分析中使用以ELISA为代表的免疫分析法。检测对象多样性是ELISA 方法的突出特点,这使其可以用于绝大部分蛋白多肽药物的药动学分析,实践中往往根据药物特性选取相应的检测模式。如双抗夹心法适用于多价抗原的检测,含有单个结合位点的小分子蛋白多肽使用间接法进行测定,陈巨冰等 建立了间接竞争ELISA 法测量聚乙二醇安替安吉肽的血药浓度。近年来,ELISA 还被用于测定血清样本中的ADA。蛋白多肽的免疫原性使机体产生ADA,以中和药效且改变药物清除。因此,ADA 的测定是大分子药物药动学研究的重要内容。桥式ELISA 是最常用的ADA 检测方法,高柳村等  在酶标板中预先包被BLyS 抗体,以捕获食蟹猴血清中的抗BLyS 抗体,再使用生物素标记的药物作为检测试剂结合已捕获的桥连ADA,该方法灵敏度达到0.64 μg · L–1。桥式ELISA 允许存在5% 的假阳性结果,因此,在初筛后还需竞争性加入过量未标记药物以验证样品响应程度。

    通常认为ELISA 方法具有以下不足: 1)无法区分药物的活性及无活性形式;2)难以准确测量组织样本;3)易受内源性及外源性物质干扰;4)相关试剂的制备周期长。需要注意的是,生物基质中结合型ADA可以竞争性结合药物的ELISA 测定位点,使ELISA 的测定结果较真实值低。有报道对比了ELISA 和LC-MS测定的食蟹猴内PEG 蛋白药物血药浓度数据,结果显示LC-MS 测定的药时曲线下面积为ELISA 方法测定值的1.53 倍 。可见,ELISA 作为应用最为广泛的免疫分析法,仍需要不断完善及改进。

2.3.2 电化学发光免疫分析

    电化学发光免疫分析(ECLIA)结合了电化学发光及免疫检测技术,在国外已广泛用于临床检测和药物分析。与传统方法相比,ECLIA 易于实现全自动化的特点使其可以极大提升分析速度及稳定性,电化学发光技术则确保了方法的高灵敏度。因此,ECLIA 可进行多元检测及均相测量,尤其适用于分析体液等复杂样品中含量极低的药物,目前已有多种上市单抗药物在临床药动学阶段使用ECLIA,如siltuximab 、pembrolizumab  等,ECLIA 有望成为继ELISA 后普遍采用的免疫分析法。

2.3.3 表面等离子共振技术

    表面等离子共振技术(SPR)是利用金属薄膜物理发光现象的新型免疫检测法,基于该技术的生物传感器由微流射系统、传感器芯片及SPR 光学检测系统组成,其原理是待测物在芯片表面结合抗原/抗体改变金属薄膜折射率,进而影响SPR 共振角。近年来多家公司推出商品化的SPR传感器,并大量用于大分子的相互作用研究及高通量测定。槲寄生凝集素Ⅰ(ML-1)是一种高效抗肿瘤蛋白,Tao 等使用Plasmonic 公司的SPR 传感器测定缓冲液与人血清中的ML-1,检测限分别为1 和1.5 mg · L–1。与ELISA 法相比,SPR 的检测速度更快,且无需样品预处理。同时由于SPR 能实时动态地反映分子间相互作用,可以建立基于SPR 传感器的体外模型,以验证药物的特异性吸收及结合动力学。当前,SPR 检测蛋白多肽药物的技术还不够成熟,相关方法的建立仍需完善。

2.4 色谱法

2.4.1 高效液相色谱

    HPLC 在小分子药物药动学分析中被广泛应用。但由于蛋白多肽相对分子质量较大且结构复杂,除少数药物(如胰岛素)可直接测定外,HPLC常需与其他灵敏度高的检测技术联用。液质联用技术(LC-MSn)是当前蛋白多肽药物药动学分析的主要方法,它将色谱的分离能力与质谱的定性功能结合,可以同时测定多种药物组分,是复杂化合物整体检测的理想方法,如ADC 药物的药动学分析多选取LC-MSn。

    一般认为由于质谱检测范围与蛋白分离方法的限制,LC-MSn 更常用于多肽药物。而酶解法的出现使LCMSn的检测范围拓展到相对分子质量为10 000~15 000 的蛋白类药物。与传统在整体水平分析的方法不同,酶解法是将蛋白多肽药物酶切成合适肽段并选取特异性定量肽进行测定。合适的定量肽对于酶解法尤为重要,其选取需依照以下原则:1)在酶解片段中的唯一性,如抗体的定量肽多选择互补决定区(CDR)的特异性序列;2)灵敏度高,可以代表原型药进行定量;3)不含易被修饰的氨基酸片段,在酶解及分析过程中保持稳定。Adnectin 是源于人纤维连接蛋白的抗体类似物,其与IgG1Fc 片段融合生成BMS-986089 蛋白。Zhu 等 用胰蛋白酶酶解BMS-986089,并选取Adnectin 中CDR 的“ITYGGNSPVQEFTVPGR” 片段作为定量肽,通过LC-MS/MS 测定小鼠血药浓度,检测范围达到390~100 000μg · L–1。此外,研究人员还提出在酶解肽段中选取“监视肽”进行同时检测,并结合其在蛋白序列中的位置获取药物结构信息,也可作为酶解法的验证手段。

    血浆等复杂样品中含有大量盐类及内源性蛋白,会对定量肽的分析产生干扰,影响其准确度与灵敏度。通常可以结合固相萃取(SPE)或免疫捕获等前处理方法去除杂质,减少基质效应。同时,酶解法采用稳定性同位素标记(SIL)的定量肽或整体蛋白作为内标,对样品处理产生的离子化进行校正,同样可以提高灵敏度及准确度。如上述的BMS-986089 测量过程中选用标记的定量肽作为内标,该方法的准确度与精密度较高(均 20%)。也有文献报道,采用SIL 的双内标会使定量更加准确。目前,使用酶解法进行蛋白类药物药动学分析的LC-MS 技术(PrD-LC-MS)已被广泛接受并使用,相关的行业白皮书也已经发表。

2.4.2 高效毛细管电泳

    高效毛细管电泳(HPCE)是以高压电场驱动待测物在毛细管中按分配系数和浓度进行分离的技术。相较于HPLC,HPCE 的进样量更少(仅为nL 级),分离性能更高,是分析痕量组分及复杂样品的有力手段。

    HPCE 可以通过与质谱联用获取结构信息,定性检测蛋白多肽药物。因此,CE-MS 同时具有高效分离及定性鉴别能力,是比LC-MSn 更加理想的联用方法。CE-MS 分为在线联用和离线联用方式,在线联用分析速度快且样品损失少,因而应用更为广泛,其难点在于HPCE 的低流速(nL · min–1)要求分离样品需转移到MS 中进行离子化。因此,设计合适的接口是CE-MS 技术的关键,CE-ESI-MS 接口目前最为常用。Nguyen 等  设计的无鞘液CE-ESI-MS 接口用于CE-MS 在线检测亮氨酸脑啡肽(LEK)药物,最低检测限达到0.045 μmol · L–1。该技术还可以对含有胰岛素、组织因子、α-Synuclein 及BSA 4 种蛋白的混合样品进行有效分离及鉴定,其中每种蛋白含量仅为30 fmol。Schiavone 等  报道了电流泵接口连接毛细管区带电泳(CZE)及ESI-MS/MS,并从BSA 酶解产物中分离出31 个肽段,覆盖了BSA 中52% 的序列。近年来,有研究者尝试将酶微反应器或微流体装置联合CE-MS 用于蛋白多肽的分析,Black 等  将微流体芯片-CE-MS及LC-MS 用于分析牛血红蛋白酶解物,与LC-MS 相比,微流体芯片-CE-MS 的分离速度及峰容量都有显著提升。目前,CE-MS 多作为传统质谱联用技术的补充或竞争方法,但随着接口技术的持续发展,该方法在蛋白多肽药物的研究中会愈发重要。

3、结语

    蛋白多肽类药物的生理活性强、疗效高、毒副作用小,是医药研发的重要方向,独特的理化性质使该类药物的药动学行为与小分子药物区别较大,因此其药动学实验设计需注意以下几点:1)采用可靠的分析方法,对游离药物、代谢物和结合药物的分离测定是蛋白多肽药物研究亟待解决的问题,当前普遍采用的ELISA 及LC-MSn 并不完全满足上述要求,但传统方法的改进及新技术的推广可帮助研究者更好地制定分析策略;2)实验设计合理, 包括动物选择、剂量确定、给药途径等,给药途径及剂量确定需结合药物特点,综合药理学和毒理学数据拟定,动物选择则要求药物在受试动物的ADME 尽量与人体接近;3)根据已知的ADME 信息及作用机制选取药动学模型进行分析,阐明药物的药动学行为,如TMDD 模型可描述靶向药物与靶点的结合过程,在机制水平反映药物体内行为;4)结合毒理学和药效学进行综合分析,蛋白多肽的免疫原性往往使宿主产生ADA,从而影响药动学反应,可通过免疫原性评价来反映药物药动学特征。而综合药效学建立PK/PD 模型则有助于非临床药动学研究的转化,为临床实验提供剂量依据。

    从整体上进行蛋白多肽类药物的药动学分析相当复杂,研究药物在体内的代谢过程及生物活性片段也具有一定难度。现代分析技术的发展给蛋白多肽类药物的药动学研究提供了多样的分析方法,但由于其理化性质具有特殊性,尚无一种分析方法可以完全满足药动学研究的所有需求,通常需要联用多种技术,进行相互补充及验证才能得到可靠的结果。相信随着更多分析技术以及样品处理方法的应用,未来可以获得更加准确可靠的蛋白多肽类药物药动学信息,为该类药物的研制与开发提供依据。

参考文献






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