蛋白质组学

表征生物药物的分析工具以及对生物仿制药的启示

单克隆抗体之类的生物制品与小分子药物相比要复杂得多,这给研发和监管评估后续版本的这些生物药物产品(又称生物仿制药)及一旦原研生物制品的专利保护到期后仿制药的临床应用带来了挑战性的难题。随着近期复杂生物制品的后续版本审批途径的引入,比较生物仿制药和相应的对照品所用的分析技术所扮演的角色正将大量的注意力吸引到建立生物仿制药的审批规定上来。在此,我们将探讨现在评估蛋白质生物药物三大特征的最先进的分析技术,它们已被监管机构认定为重要的生物仿制药开发策略,它们是:转录后修饰,三维结构和蛋白质聚集。

如单克隆抗体和重组内源性蛋白之类的生物制品在临床和商业上的成功正在改变医药行业。到2010年,世界范围内所有生物制品的销售额已冲破1000亿美元大关,预计到2015年,超过50%的批准新药将是生物制品,而到2025年这一数字将会上升到超过70%。随着这些药物逐渐失去专利保护,其他公司就得到了大量的机会来复制或生产仿制版的这些药物。

用于开发和引进仿制版的小分子药物(在原研药专利保护到期后)的简化审批途径已经建立了25年有余。简化审批途径一般是基于证明仿制药与原研药相比制剂等效(即仿制药含有相同纯度、效力、剂型和给药途径的活性成分)以及生物等效(即仿制药以相似的速率和程度被人体吸收),而不需要让仿制药也经历像原研药那种水平的评估(包括临床试验)。因此,简化审批实现起来费用明显不那么昂贵了,从而极大地降低了仿制药的开发成本。这导致了仿制药的广泛使用并为医疗保健体系节省了大量的开支,一篇最近的文章提到2009年美国接近75%的处方配发的小分子药物为仿制药,并且一种仿制药的批准通过使其在一年内比原研药平均节省77%的开支。

然而,为生物制品建立一种审批途径用于引进原研药的后续版本(一旦原研药专利保护已过期)要比小分子药物挑战更大。一些简单的生物制品,例如重组胰岛素和重组人生长激素之类的小肽可以通过已有的分析方法得到很好的表征,这易化了后续版本循简化审批途径(部分基于原研药的数据,部分基于分析数据,一些情况下只需有限的临床数据)获得审批通过。然而,很多的生物制品如单克隆抗体和其他的重组治疗蛋白结构更大更复杂。这些生物制品只能比小分子药物更有限程度地得到已有的分析方法的支持,支持仿制药和原研药在临床可比性上的可能性,并且要证明这两种药物完全相同是不可能的。

因此,开发和监管后续版本的生物制品(又称为生物仿制药)的一个关键问题是需要多少以及何种数据来确立仿制药和原研药之间的差别不具有临床重要性。

无疑,正如仿制的小分子药物那样,开发一种生物仿制药的全面成功依赖于生物仿制药的开发者提供一种高度相似、安全以及有效的药物产品,从节省成本的角度鼓励医疗人员购买仿制药而不是原研药且使得生物仿制药开发者依然有足够的获利。如果可比性或相似性的标准设得太高,经济上的吸引力对公司而言就不够了,打击了它们参与的积极性。然而,如果可比性或相似性的标准设得太低,药效及病人的安全可能会处于危险的境地。凭借政府监管人员手中握有设定这一标准的权利(再加上越来越多商业上成功的生物制品的专利保护近来或即将到期),全球的监管机构正在为引进生物仿制药建立途径,目的是为了实现最终想要获得的益处。

在欧洲,欧洲药品管理局(EMA)于2005年引进了第一个运行框架,旨在为生物仿制药的开发和上市开辟通道。自此,欧洲生物仿制药指导方针描绘完成(参看EMA网站),13种生物仿制药已经获批并依然存在在市场上。在美国,2009年的生物制品价格竞争和创新法案授予美国食品药品管理局(FDA)在美国境内建立一条途径以引进生物仿制药的权利,该指导方针草案于2012年2月9日颁布(参看FDA网站,参考资料1,2)。在起草这份草案时,FDA发起了一场听证会,该听证会于2010年进行,旨在从风险涉众处获取关于生物仿制药四个主要方面的意见:第一,管理局应该考虑什么科学和技术因素以确定生物产品与对照品是高度相似的(尽管在临床无活性组分上有小的差异)?第二,管理局应该考虑什么科学和技术因素以确定适合的分析、动物和临床试验(或多次临床试验)来评估被提议的生物仿制药产品及其对照品之间实际或者潜在的结构差异的本质和影响?第三,如果申请人可以证明被提议的生物仿制药产品和对照品之间不存在任何临床上有显著意义的差异,被提议的生物仿制药产品和对照品之间什么范围的结构差异是与"高度相似"这一标准一致的并且是351(k)申请可以接受的?第四,在什么情况下管理局应当考虑提交351(k)申请时动物试验或临床试验(或多次临床试验)是不必要的?

依照FDA的观点,治疗蛋白的三种性质(与这些方面中的几个相关)虽不能得到充分测量但被认为对理解蛋白质药物的行为是重要的:转录后修饰,三维结构和蛋白质聚集。考虑到存在快速促进我们检测这三种性质的能力的需求,现在正是回顾目前可行的用于产生关于这些特性的数据的分析方法的时候,在本文中我们依照FDA和EMA发布的指南对此进行了讨论。然而,在考虑这三个已被鉴定为能促进分析的主要方面之前,重要的是讨论一下在评估可比性方面一些普遍的挑战。

评估可比性的普遍挑战

评估生物制品可比性时的第一个挑战是正确理解"可比的","相似的"和"高度相似的"词的含义。在开发创新生物制品时,生产过程通常经历无数次改变(由于各种各样的原因),有时甚至在药物商品化以后还会发生改变。结果,创新者为了能将这些改变后的药物用于任何接下来的临床试验或已经商业化许可的产品,需要进行可比试验以向监管人员显示药物产品在流程改变前后是"相当的"。在此,我们将这类比较称为内部比较。开发一种原研生物制品的仿制药版本时,生物仿制药的生产者必需执行一项更具挑战性的任务以证明其生物仿制药与原研药相比是"相似的"(EMA用语)或"高度相似的"(FDA用语)。在此,我们将这类比较性称为外部比较。应该注意到可比的,相似的,高度相似的这些词是EMA和FDA为了上述目的使用的专有名词(参看FDA网站),所以使用这些词时应加以小心,请看下文。

EMA处理生物仿制药的首要问题可比性(在此定义为外部可比性)采用的方法是内部可比性概念的逻辑延伸,内部可比性概念最初由FDA提出,并被人用药品注册技术要求国际技术协调会议(ICH)Q5E指导方针概念化(参看参考资料3)。事实上,欧洲仿制药协会(EGA)在其对FDA
2010年的公开生物仿制药会议的回应中指出:应注意到EMA从未限制过任何一家公司对其自身产品的生产改进提出的可比性申请,而是将其视为一项与被比较的两实体的来源(生产改进或生物仿制药)无关的科学评估。因此,尽管我们都认识到ICH
Q5E将可比的定义为有高度相似的质量属性并将其使用限制到一家公司自身的产品,但是欧盟指导方针在相同的监管文件中交替地使用着相似性和可比性这两个术语并认为这两个术语指的是相同的科学原则。EGA进一步指出:鉴于欧盟的成功,相似性和可比性的科学基础是相同的,监管者极力将这些原则一贯地应用到原研生物制品和生物仿制药上。高度相似性形成了简化临床程序、可批准性、适应症外推、可互换性和病人及医疗人员信任的基础。

然而,上述EGA声明中的潜在要害是这样一种方法暗示生物仿制药的生产者拥有:第一,与创新者就原研药的特性和行为有同样广博的知识面;第二,为作出比较可获得适当的对照材料。关于第二点,尽管存在对照品的来源可通过在开放市场上购买原研药以解决的观点,这种方法自身还存在问题。原研药的配方基质可能会干扰原研药和生物仿制药之间必需的比较试验。因为可能需要某种类型的去配方或从原始药物产品配方中提取活性成分,这样处理样本可能会导致产生的对照材料有所改变并进而产生误导性的比较结果。这一问题已被EMA和FDA意识到,因此正需要一种有效的去配方和从商品化药物产品中提取活性药物成分的方法(参看FDA网站)。

实现这种有效的去配方和提取流程的一种可能的方法也许需要生物仿制药的生产者将其药物分子放入与原研药相同的配方中并与原研药共同处理以进行更潜在有效的对比试验。

关于适宜的对照材料的一个更有趣的点是相对于评估生物仿制药的监管机构的裁决范围而言对照材料的来源。对EMA而言,对照材料必需来源于其裁决范围,而对FDA而言如果能提供这种材料和一种美国批准的对照品的一种可接受的衔接研究那么在其裁决范围之外的对照材料也可以使用。

第二个挑战是定义可比性的可接受程度以证实两种或多种生物制品事实上是可比的、相似的或高度相似的的声明。正如之前已说过的,鉴于蛋白质生物药物及其生产过程的内在复杂性使用"相同的"一词是不恰当的。对蛋白质药物,简单的改变,如单个氨基酸的突变或共价修饰(转录后修饰,PTM),都可能导致高级结构的微小变动。这些微小的变动可能导致药物不起作用,或者更糟的是,由于聚集或免疫原性导致药物失效。因此,定义作为可接受程度的词"可比的"、"相似的"和"高度相似的"真的是一大挑战。特别是,如本文之前提及的,在生物仿制药领域"相似的"一词专门被EMA使用,"高度相似的"一词专门被FDA使用。不幸的是,这种词的使用只是进一步增加混淆,所以值得再次强调决定如何以及何时使用这些词时应特别小心。就EMA而言,已制定了各种各样产品特异的生物仿制药指导方针(参看EMA网站)(例如,重组红细胞生成素和粒细胞集落刺激因子)并继续在制定指导方针(例如干扰素β和单克隆抗体)来帮助指导生物仿制药的申请者更有效地规划他们的可比性实验。

接下来,我们将讨论治疗用蛋白在FDA看来不能被充分测量(如上述讨论)的三大特征,以及可获得的和正在开发的用于确定这些特征的分析工具。我们还将根据这三大特征相关的审查指南讨论开发生物仿制药的关键挑战。

转录后修饰

蛋白质有多种转录后修饰。常见的转录后修饰有糖基化(包括半乳糖苷化、岩藻糖基化、高甘露糖衍生物和唾液酸糖苷化)、氧化、磷酸化、硫酸化、脂质化、二硫键形成和脱酰氨基化。这些化学变化大多数发生在体内,但有些化学变化在体外也能发生:例如,在生产过程中的各个阶段如纯化和贮存。

转录后修饰带来的变化对蛋白质活性有影响,所以在生产生物制品时有必要表征并理解他们。另外,转录后修饰可能会影响生物制品的免疫原性。几篇全面的综述谈及生物制品的免疫原性并含有转录后修饰对免疫原性的潜在(一个或多个)贡献的讨论。对几种转录后修饰(例如脱酰胺基化、氧化和差异性糖基化)而言,临床上并没有显示出生物制品的转录后修饰和免疫原性间有直接的关系。尽管如此,我们已经知道转录后修饰可以改变蛋白质结构和导致聚集,并且这些改变可以引起免疫原性的问题(下文还讨论了糖基化和氨基酸异构化)。因此,注意到转录后修饰和理解他们对每种生物制品的作用是至关重要的。另外,要证明一种生物制品的生产是可重复的,生产者需要在生产过程中监测很多步骤中的转录后修饰,监测过程需要识别转录后修饰、控制其水平和评估他们对蛋白质的影响。开发和商品化生物制品过程中允许的转录后修饰变异性水平可以改变并通常由他们的重要性和之前的生产历史中的相关信息决定。在大多数情况下,不同的转录后修饰对变异在数量上、水平上和形式上的明确影响(或临床结果)还为未可知。

尽管转录后修饰的表征是蛋白质组学研究中一项非常让人望而生畏的任务(在同一样本中,如果没有上千的话,也有成百个蛋白质要研究),生物制品代表一种简单得多的案例。对生物制品,蛋白质的序列和一致性已知,各种各样的修饰形式通常可以分离得到,有时候数量巨大。所以,生物制品转录后修饰的表征比在全面的蛋白质研究中更直接。仪器出售商设计了软件用于识别修饰是否存在、修饰的数量以及有时候确定修饰发生的部位。然而,转录后修饰的分析并不是没有极限的。尖端的仪器、熟练的分析员和时间都是必需的。尽管电脑和自动化减轻了负担,还是有很长的一段路要走。

质谱分析(通过检测质量的改变)是检测和研究蛋白质修饰的一种极为有用的工具,他们可以用于确定修饰发生在蛋白质上的哪个部位(通过分析肽段和他们的质量的改变)和用于阐明什么导致了修饰(通过比较不同种类的样本、贮存条件和配方)。几篇关于将质谱分析用于转录后修饰这个主题的详尽的综述重点讲述了一些趋势。最近,一种趋势是越来越强调了解参与到糖基化过程中的糖类的本质的重要性。考虑到各种各样的细胞系、表达宿主和实验方法都能导致不同的糖基化形式,通过质谱分析测定和了解糖基化是至关重要的。另外,要了解批次和批次间的差异和比较原研药与生物仿制药蛋白,就需要确定糖基化发生的部位(这在肽图分析实验中相对比较直观)和单糖的结构和含量(这就更难了,即便对于质谱分析而言)。

例如,一项比较一种原研的组织纤溶酶原激活物及其生物仿制药的糖基化形式的研究证实在原研药中一个N联糖基化位点上糖基化的数目是生物仿制药中的2.5倍。一种原研单克隆抗体曲妥珠(赫赛汀;基因泰克/罗氏)和一种生物仿制药之间的区别通过液相色谱-质谱分析(LC-MS)很容易就能检测到,包括重链上糖基化的改变和氨基酸的突变。酶消化后用LC-MS分析重组及人源凝血因子IX表明人源蛋白和重组版本的岩藻糖基化位点是不同的。这些差异的临床后果尚不清楚。最近报道表明尽管观察到依那西普(恩利;安进/辉瑞),阿法达贝泊汀(Aranesp;安进/协和发酵麒麟株式会社)和利妥昔(美罗华;百健艾迪/基因泰克/罗氏)在流程改变被批准后糖基化水平有所改变,但这些改变的临床后果尚不清楚。

在少数案例中,涉及一个或两个单糖和/或它们连接特异性之间的差异(大多数源于不在人体中合成而在用于生产重组蛋白的哺乳动物的细胞中合成的糖类)和免疫反应联系了起来。半乳糖-α-1,3-半乳糖连接或末端-α-1,3-半乳糖与西妥昔单抗(爱必妥;百时美施贵宝/礼来/默克雪兰诺)的过敏反应和对牛凝血酶的免疫反应有关。已知唾液酸N-羟乙酰神经氨酸(Neu5Gc;又名NGNA)与免疫原性组织相关,所以非常期望能减少或消除重组蛋白中的这类糖。最近,对西妥昔单抗和帕尼单抗(维克替比;安进)中Neu5Gc的比较显示Neu5Gc存在于西妥昔单抗而非帕尼单抗,并显示向培养基中添加Neu5Ac(N-乙酰神经氨糖酸)减少了Neu5Gc的吸收。因此,质谱检测糖类的改变的能力对生物制品而言是极为有用的,包括用于通过发现非一致性添加分析人类糖基化通路和用于评估不同的糖基化形式是否有临川意义。

应用质谱分析研究转录后修饰的另一个趋势是人们注意到了修饰本身可以被该分析方法所改变。为了矫正这一缺陷,近年来可替代经典的碰撞诱导解离的质谱裂解方法的其他办法日益变得越来越重要。自下而上的方法,即将蛋白质分解成肽段然后确定所有肽段的质量的方法的价值已很好地确立了,但是现在证明用自上而下的方式来分析也是有用的。在自上而下的分析中,质谱仪内进行的是全蛋白的表征(而不是裂解片段的集合),其中如电子转移裂解(ETD)和电子捕获裂解(ECD)之类的裂解方法被用于将蛋白质裂解为更小的片段进行更详细的分析。ETD和ECD不仅能够保存不稳定的转录后修饰,而且能够保存常见的蛋白质不稳定结构(如二硫键)(这些结构可能会在其他裂解方法中被弄混乱)。

氨基酸的异构化是转录后修饰的另一种重要的形式,其检测正受益于不断发展的技术。一种让人特别不安的氨基酸是天冬氨酸因为它可以很容易地异构化形成异天冬氨酸(isoAsp),有报告称这会有某些不受欢迎的免疫原性后果。异天冬氨酸形成可能是通过天冬氨酸直接异构化或者是通过天冬酰胺的脱酰胺作用,它从一种常见的琥珀酸盐中间体转化而来。这些微妙的异构差异(质量差异为零)很明显给检测和分析带来了重大的挑战,并且这一问题在大的蛋白质中更为复杂。质谱可以被用于检测和表征异天冬氨酸,尤其是配以ETD或ECD。一个涉及β-淀粉样蛋白的案例,在天冬氨酸残基位点进行酶切(使用胞内蛋白酶AspN),借此ETD-MS可以在低至0.5%的水平定量异天冬氨酸/天冬氨酸的比例。然而要实现这种分析可能需要相当多的专业知识和时间。

定位、检测和表征蛋白质上的N联糖基化的一种不错的办法是将其酶解下来然后用质谱进行分析。然而,在O联糖基化的情况下必需非常小心因为化学裂解和释放步骤通常可能会引起糖链本身的断裂,所以可能需要考虑替代策略。虽然O联糖基化位点可以通过新的更软的电离质谱技术在完整的蛋白质上被检测到,但是连接位点共价结构的信息通常很难通过质谱分析得到。一种非常适合O联糖基化分析的方法是核磁共振光谱分析法。事实上,这就是在大量报道的肝素污染案例中使用的突破性技术,在此案例中,污染物过硫酸化硫酸软骨素被600MHz的核磁共振光谱探测到,还显示了O联糖链的位置、一致性和转向。

传统NMR分析蛋白质的一个普遍的限制因素是需要大的样本数量(高达约20mg)以收集有意义的数据。然而,NMR技术最近的发展包括流式NMR和最新的微型线圈NMR已改变了这一看法。在后一种技术中,检测限低于100pmol时仍可能获得高质量的光谱。在最近一个分析蓝藻细胞提取物的例子中,检测液相色谱分离后只占混合物1%的代谢成分已成为可能(总注射量为30μg)。偶联MS与NMR后分析能力更为强大。LC-MS-NMR技术能够很好地平衡MS和NMR方法在要求上的巨大差异(如样本质量和分析时间),并利用NMR弥补MS分析无法确定结构的缺点。这一技术对生物制品一项颇具吸引力的扩展可能是首先用高效液相色谱和超高效液相色谱分离用于蛋白质组学研究的混合物,然后将流出物分成两份,一份用于质谱,一份用于串联质谱,再用微型线圈NMR分析所选特征。LC-MS-NMR技术将来的发展有望被应用于表征转录后修饰。

高级结构

尽管分析初级结构的工具的开发取得了重大进步,正如上文所讨论的,但是这些研究中缺失的是转录后修饰对生物药物产品三维结构的影响的认识。确定蛋白质三维形状和最终影响蛋白质功能的是蛋白质的高级结构,即二级、三级和四级结构。因此,监测完整蛋白质的高级结构的能力对表征生物制品有着显著的重要性。高级结构的差异不仅为任何蛋白质及其变体形式(即带有转录后修饰的蛋白质)之间观测到的生物学和/或免疫学差异提供可能的线索,而且还可以作为评估生产过程改变前后原研药产品不同版本之间以及评估原研药和生物仿制药之间缺乏相似性的一种方法。

尽管表征生物药物蛋白的高级结构是一项重大的挑战,但是通过特殊分析方法在各种各样的前沿领域的使用,我们取得了不错的进展。蛋白质的高级结构是各种力相互作用的结果,很多力当单独考虑时都很微弱,但结合后就变得强大。对所有蛋白质而言,这些弱的相互作用在整体构象和构象动力学中扮演重要的作用。在生物药物蛋白的生产过程中(包括如细胞培养、过表达、纯化、转移、储存和处理等步骤),可能会遇到能扰乱蛋白质中某些弱相互作用力的因素,导致在不改变蛋白质一级结构的情况下改变其三维结构。此类改变可以很形象地被称为沉默改变因为它们没有化学共价特征,化学共价特征可以作为改变的探测依据。由于没有可以探测和表征这些构想变化的分析工具,其对结构-功能相互关系的影响尚未为可知。最后,溶液中的蛋白质动力学(包括蛋白质结构呼吸,多肽链弯曲,不规则的局部结构和局部蛋白质结构去折叠)是蛋白质行为的另一项重要属性,但由于缺乏适宜的实用常规分析工具(见下文讨论)所以在生物药物分析中对其几乎一无所知。

蛋白质结构测定的两种主要技术是X射线晶体衍射和NMR。不幸的是,这些技术用于高级结构可比性研究时出现了较大的问题。X射线晶体衍射对常规测试不适用的原因是样本必需首先被晶体化--由于结构的原因(即由于蛋白质中转录后修饰和/或无序区域的存在)能否结晶是一件不能确定的事情。借由X射线晶体衍射的结构分析也通常太过耗时,对于常规生物药物分析太过复杂。对于NMR,蛋白质生物药物大的结构(及其结构原件复杂的排列)、对NMR信号相对低的敏感度和生物药物中活性核(除了1H同位素)低的天然丰度都使得这项技术对常规高级结构可比性研究而言显得不实用。然而,在特定的情况下,小的蛋白质生物药物正在被开发,用简单的一维1H
NMR产生NMR指纹可能提供了一种非常有用且实际的可比性评估方法。

使用二维NMR检测生物药物的实例已有报道。然而,这些应用也只是用于小的蛋白质生物药物,并且为一个样本上就需要花费很长的时间采集数据(尤其是使用了活性核的天然丰度水平时),这同样使得该方法对常规应用而言显得不实用(常规应用需要比较很多样本)。虽然现在应用NMR于常规的蛋白质生物药物可比性分析的机会有限,但是我们注意到似乎这一技术用于多糖类生物药物更为可行(见下文关于NMR和肝素的简要讨论)。

其他经典的生物物理技术如圆二色谱、(内源)荧光(光谱)、差示扫描量热法、等温量热法、分析型超高速离心(AUC)、尺寸排阻色谱(SEC)和各种各样的染料结合分析法可被用于表征蛋白质结构。这些方法的主要局限在于他们提供的信息普遍来源于被检测蛋白很多不同部位输入信号的总和。这类检测所得到的信息对应的是生物药物整个结构的全体平均值。例如,圆二色谱检测表明的只是蛋白质中存在的每种主要的基本二级结构元件(α-螺旋、β-折叠、无规卷曲)的平均百分比。如果所分析的蛋白质含有几种α-螺旋并且被比较的两个样品中的一个样品上只有一种α-螺旋的一部分被修饰了,生物药物学家面临的是试图从两个巨大的信号中区分出一小部分不同信号的艰难任务。另外,检测这种差异的能力也会随着内在噪声水平的变化而变化,而内在噪声水平在很多情况下与实际差异相比显得比较大。

因此,经典的生物物理工具并不是很适合检测小而细微的蛋白质构象上的差异或者即便生物药物产品发生了较大的改变但是这些改变了的分子只代表溶液中所有分子中的一小部分。即使观察到了改变,这些技术只能提供很少甚至无法提供改变发生在分子中的哪个部位的信息。因此,我们很需要其他能够以一种实用且常规的方式提供更多信息的方法。

蛋白质标记方法如氢氘交换质谱(HDX-MS)和共价标记策略的使用对检测生物药物高级结构中微小的变化来讲是有价值的。重要的是,当探测到改变时,这些技术可以提供关于生物药物分子中改变发生部位的信息。在HDX-MS中,蛋白质暴露于重水(D2O)中,于是可交换的氢原子被标记上了氘,因此每个氨基酸上增加了一个额外的可测的单位质量。这种交换是由蛋白质结构和动力学所决定的。通过在生理条件下进行交换和实时分析,可得到蛋白质动力学方面的信息和蛋白质高级结构间可比性的信息。HDX-MS提供含有丰富信息的数据,高度敏感(完全表征只需1-2纳摩样品),可以自动进行,并可以定位生物药物特定区域上变化或差异发生的部位;更有,单个氨基酸水平的分辨率已经成为可能了。目前的局限仍然是解释数据所需要的分析时间以及由于质谱分析不兼容溶液环境(例如含有洗涤剂的缓冲液)而引起的复杂性;然而,这些局限最近几年已经有了重大改进。

最近,HDX-MS被用于研究一种重组免疫球蛋白G1单克隆抗体的构象和构象动力学,并被用于监测移去其糖链、改变其寡糖结构和受体相互作用后其高级结构的改变。获取这些以及类似数据的能力对构建生物药物结构方面的完整图像起到帮助的作用,结构方面的完整图像对于了解其功能、最大化其稳定性和了解如糖链类的转录后修饰如何影响局部以及整体特征和性质起到至关重要的作用。由于HDX-MS可以显示蛋白质高级结构中的细节以及蛋白质动力学,该方法有潜力成为评估原研药及其生物仿制药之间相似性实验的一种重要工具。需要提到的是,由于HDX-MS可以被用于监测生物药物与那些被认为对其生物学功能非常重要的靶蛋白之间的相互作用的效果,所以这项技术在生物药物研发阶段可能也有重要作用。

由于高级结构的很多方面可通过正确地形成二硫键驱动,所以在蛋白质的生产和处理过程中,知晓他们的位置和核实他们正确形成了是非常重要的。在最近的实例中,通过LC-MS在血液凝固调控因子tPA和治疗用单克隆抗体上对二硫键的分布进行了全面的表征。分析这些生物药物的关键是使用小心控制的酶解、软电离(电喷雾电离)和温和的破碎(ETD)。在这些方法被开发出来以前,广泛使用的是同源比较建模法(借助已有的晶体结构)。在实际的药剂上进行测量的能力,不论有多复杂,都将成为确定含有二硫键的蛋白质样品间结构相同的一种标准工具。

另一种可以提供高级结构信息的方法是离子迁移/淌度光谱技术(IMS)。在IMS中,关于蛋白质构象的信息通过探测气相中分子的碰撞截面产生。然而,该信息的使用,依赖于离子化和转变为气相时对蛋白质天然型结构的天然状态或重要属性的保留;这一点现在已经被充分意识到了,尤其是来自于在蛋白质和蛋白质复合物的天然质谱上的工作。IMS可以被用于表征的事物包括:聚乙二醇化修饰蛋白药物的效果,潜在的先导抗体产品和抗体其他方面的参数,以及诊断聚集物的存在。

当前的分析方法在评估生物仿制药高级结构时无法做到的一个方面是发觉小部分构象改变的活性药物的存在,它们在给定的样品中大约只占正常分子总数的10%(或者少于10%)。不幸的是,这些生物药物的少数构象形式是在动态平衡状态下一系列复杂的紧密相关结构混合物中的一部分,这使得表征它们的任务尤为艰巨。

使用当前的技术解决这些问题的最佳机会是基于将分离方法如色谱或电泳(在维持生物药物的天然构象和构象总体分布的条件下进行)与在线结构分析方法或其他正交分离方法结合起来的分析技术。这些可能的方案包括离子交换色谱(IEC)分离与MS(使用一种适合MS的缓冲体系)来进行IEC天然或天然样的MS。在此,电荷态分布可被用于提取各种分离的药物变体上的信息以评估它们的构象和聚集状态。另外,如果质谱拥有了IMS或HDX-MS的能力,串联方法如IEC-IMS-MS或IEC-IMS加气相HDX-MS可以被用于分离复杂的混合物。这些分离分析系统有望使生物药物变体成分(来源于共价和非共价PTM)定量成为可能,即使当这些成分以非常低的水平存在。

聚集

生产蛋白质生物药物的一个让人担忧的大问题是它们倾向于形成聚合物。这些不受欢迎的单体形式的连接状态可以是可逆的也可以是不可逆的,在大小上可以从一个二聚体到可能包含万亿个(甚或更多)单体以至于可以被肉眼观察到的粒子。总体而言,聚集可能是任何蛋白质生物药物都要面对的问题。除了降低药物的实际剂量浓度这一显著有害影响外(因为与单体形式的药物相比许多聚合物没什么活性或者已大大降低了药物活性),到目前为止对聚集物的存在最大的担忧是无法预计它们产生有害的毒理学作用和免疫应答的能力,在极端情况下,这种能力会导致危及生命的严重反应。结果,聚集领域已吸引了大量研究的注意。过去几年积累的一些不充分的证据指出这些聚集物如数量、大小和天然样重复排列结构等因素是这些有害作用的潜在关键原因。因此,生物制药产业就其方向、定量和表征而言如何检测和评估蛋白质生物药物聚集得到了大量的监督和广泛的兴趣。

最近有一些优秀的综述涵盖很多有关检测和表征生物药物聚集物方面的挑战。《当代药物生物技术》最近有完整的一期(2009年6月,第10卷)都用于报道聚集方面的研究进展。很多技术文章中都列举了可用于探测、定量或表征聚集物的分析技术,文章中还讨论了每种技术的优点、局限和细节。不幸的是,所有这些探测和定量蛋白质聚集物的技术在能力上都有缺陷。

SEC已经是,并很可能将继续成为用于表征蛋白质聚集物的主要方法,这是由于它简单、廉价、所需样本量少、易于使用、高速和高通量。尽管SEC柱的进步产生了大量分辨率改进的超高效尺寸排阻柱,这使得可以用更少的样品和在更短的时间内作出检测,但是其他方法在使用SEC时暴露了正确性问题和局限性。正交分析方法,如AUC和不对称场流分离技术(AFFFF,或AF4,又称为场流分离(FFF))可以提供一定水平额外的担保以保证SEC方法获得的数据是准确的。事实上,监管机构正要求提交使用正交聚集评估方法得到的数据,如AUC或AF4,来帮助评估SEC方法。尽管AUC和AF4可能无法像正确运行的SEC那样精密和准确地对聚集物进行定量,它们与SEC数据结合时在探测和定量聚集物方面的正交本质降低了使用SEC时所遇到的未注意到粗差的可能性。这些差错包括由于被SEC柱移去或在SEC操作中被分离而无法探测到聚集物。因此,很明显,现阶段没有哪一种方法是分析所有形式的聚集物的最佳手段。

鉴于免疫原性关系到周围聚集(正如本节之前所提示的),最近关于聚集整体的重要认识引起我们对以下这种情况的担忧:大小落在SEC,AUC和AF4可分析测量的范围(小于或等于几百万道尔顿)和落在光阻法和直视检测法测量的范围(大于或等于10
μm)中的聚集物缺乏特殊检测。这种中等大小的聚集物(从0.1 μm到接近10
μm)包括用显微镜才能看见和微米级以下大小的粒子,它们处在可溶性的边缘,并且只有很低的浓度。评估这些粒子的技术包括动态或静态光散射,或近来使用光散射或直接使用显微成像的新流式成像仪。使用拉曼光谱仪(参见rap.ID粒子系统网站)或傅立叶变换红外光谱来采集这些中等聚集物的化学组成的能力可以用于证明它们代表的是有效的蛋白质药物产品还是某些外来的物质。

综上,尽管已有可以检测介于范围(约为0.1-10
μm)的聚集物的分析工具,但是由于每种特定的分析工具在粒子大小范围、粒子性质(例如,粒子的透明度)、粒子浓度、样本浓度和报告数据的方式(单位体积内特定大小范围的粒子数目
单位体积内特定大小范围的粒子的质量浓度)上有固有偏好,挑战依然存在。其他改进或补充外观测试和光阻法的方法虽然也普遍用于尝试检测这些聚集物以及可见粒子,但是目前还没有完全认可这些方法。

影响、采纳和法律后果

本文中描述的方法为分析蛋白质生物药物的关键性质提供了强有力的分析工具。监管机构和生物药物生产者面临的困难将会是决定(对内部和外部可比性而言)需要进行何种检测、获取的数据的显著性和不可接受的差异的水平。在这项探索中,数据的精密度和置信水平是至为关键的。最后还需要进行一些相关性分析,即检测到的参数和患者服用药物后的效果之间的相关性。换句话说,所有这些分析过的属性真的和药物的稳定性、临床结果或活性药物成分的功能活性有关吗?对生物仿制药而言,一种可能的决策是:基于仿制药被认为与原研药在分析上是高度相似的前提,生产者不再需要进行全面的临床实验,这在经济上有显著意义。

在这个过程中的某些时候,对原研者和生物仿制药的开发者同样重要的是决定哪种分析方法适宜包含在申请文件中,这些分析检测对生理化学稳定性和临床相关性的评估作出了何种程度的贡献,尤其是对涉及生物仿制药的临床不良事件的担忧(参见FDA网站2010年10月27日发布的新闻)和评估免疫原性方面的可比性这一恼人的问题。会在患者身上引起免疫应答的潜在蛋白质生物药物的性质还了解得很少并且目前对生物药物进行体外或体内(动物)测试、结构或者分析检测都无法充分预测这种可能性。然而,大家都知道各种各样的因素可以影响免疫原性,包括药物本身、制造过程、患者的遗传背景和病史以及药物的给药方式。目前,只有临床试验才能提供确定的数据,但这些数据可能只有在药物开发的后期甚至药物批准以后才能得到。

据预测生物分析方法将会继续以飞快的步伐前进,但同时会伴有很多的挑战。首先,监管者需要与这些方法的发展保持一致同时要要求产品申请者提交的申请中的分析方法能产生大量信息。然而,这样做要求监管者了解这些高级分析工具的能力和不足,并且随着这些新工具的不断发展而不断进步。第二项挑战是让无数的小型生物制药公司得到这些更高级的分析技术,这些小公司可能难以支付这些技术高额的费用,如必须的设备和能够高度熟练进行测试和解释数据的员工。第三项挑战是设备生产商在开发、维护和改进这些工具时所面临的成本。在此,我们需要平衡研发投入、未来有限的利润(考虑到能够卖出的药物数量可能相当地低)和这些工具能为生物药物产品提供的表征信息的重要性之间的关系。

为了维持最大的商业可行性,仪器生产商很可能会将他们的资源集中在能创造最大利益的地方。困难还会接着出现,如果出现市场已接近饱和而此时又需要对仪器作出进一步改进但是这种新的设备或改进自身无法强制终端用户再购置一台全新的仪器的情况。例如,AUC这种非常重要的技术现在唯一的生产商(贝克曼库尔特,它开创了该设备的商业化发展)不管电子、探测器、电脑硬件和软件以及产品质量检测问题方面长足的发展,20多年来并未对该仪器提供巨大的改进。这种局势可能使得对本可以充分利用的技术可以真正带来的精密度、准确性和置信度作出妥协。

另外一个随着这些先进的仪器和方法被开发出来并变得常见所带来的隐患与对药物生产商的尽职调查有关。对产品没有进行足够的分析表征带来安全上的问题是很有可能的,正如肝素污染案例所示。在这个案例中,简单的一维1H-NMR检测很容易显示污染源的存在。真心希望生物药物生产商和监管机构能充分认识到他们可以获得的新兴生物分析技术所带来的后果以及已有技术尚未充分开发出来的潜力能给生物药物产品安全性检测带来的帮助。在未来的监管文件中不采用和/或包括这些方法可能会使公司容易遭受产品召回和患者的诉讼,但更重要的是,它可能给病人带来了不必要的伤害。此外,据预测,不论是对原研药还是生物仿制药生产商,这些新的表征工具将在药物组合物等效性的知识产权和专利相关的诉讼中起到决定性的作用。

考虑到建立有效的生物药物可比性和相似性判定标准的重要性,我们期望与产业、监管机构和学术团体合作的分析仪器生产商能开发出更敏感更靶标特异的分析技术。同时,(在政府内部或私有领域内)建立真正独立的参比实验室也对进行深入的生物分析测试有益处。最近,一份美国政府问责署的报告援引了帮助FDA解决肝素污染事件的生物技术公司与FDA可能存在潜在利益冲突这一事例。因此,这种方法,如果采用的话,实践过程中必须非常小心。除了参比实验室,开发可以使用的标准化分析法也有巨大的好处,尤其是用于比较的目的,解决生物药物和生物仿制药开发过程中出现的复杂问题。政府基金可以帮助建立参比实验室、仪器设备公司和研究院,这些基金用于鼓励他们开发、维护和改进那些重要又关键的参比标准、仪器设备和技术方法,获得这些基金的机会同样值得认真考虑,因其也有助于解决本文中提到的一些挑战。

最后我想说,现代的分析技术使得生物药物的表征得到飞速的进步。然而,尽管我们对生物药物和它们对患者的作用的了解日益增长,但是我们对有机体的工作原理所知甚少,因为每个回答了的问题似乎总会牵涉出更多新问题。一种明智的生物药物表征发展之路是努力填补我们已知和未知之间的空隙;然而,我们不能等到这些空隙都填补完了才有所动作。我们需要搜集一切我们能从可获得的最佳的分析工具上得到的信息作出可行的最佳决策。借助所有风险涉众(包括公众)都了解和接受的"风险管理计划",我们需要将生物仿制药的发展过程继续向前推进。如本文所描述的那些分析技术将在此过程中扮演重要角色,其应用可以增进我们对未知的了解,降低与生物药物相关的风险。已故的乔治·萧伯纳的话很好地体现了这种方法:"唯一一个表现得理性的人只有我的裁缝,他每次看到我都会重新量一次,而其他人只重复使用以前测量的结果还期待它们适合于我。"

参考资料1:FDA拟对生物仿制药提出的审批途径在美国受到的

2009年的生物制品价格竞争和创新法案授予了美国食品药品管理局在美国境内建立一条途径以批准生物仿制药的权利。2012年2月,FDA发布了3项草案(参见FDA网站)用以支持建立一条初始通道,生物仿制药开发者循此通道可以实现药物的批准,2012年5月11日,FDA召开了为期一天的公共听证会获取对指南草案文件的建议。FDA描述的这条新的通道(如参考资料2中示意图所示)基于一种基于风险的方法,该方法被FDA称为"一揽子证据"。

大体上来讲,这项办法第一眼看上去就知道它不是全新的。任何生物药物产品的批准都是基于以数据包申请的形式提供给FDA的一揽子证据,通常情况下,任何新药研发主办人都需要提供该数据包申请以支持药物的批准(不论是申请一种全新的药物还是对已有的药物的改变,包括由相同的新药研发主办人主持开发的第二代药物)或获得进行临床试验的批准。该"一揽子证据"数据包包括生物化学、生物物理、生物学、毒理学以及临床数据。然而,对于一种生物仿制药而言,原研者的工作(以及该药物的商业史)已充分证明该原研药足够安全和有效。关键问题是:生物仿制药和原研药相比需要多么相似或者可比才使得它可以充分利用原研药过去的经历和长长的历史(尤其是关于支持生物相似物获批的临床数据所需要的程度)?

FDA在其最近的指南中以及早先的发表物中强调的一个重要结论是上述问题的答案并不唯一。尽管在药品的化学、制造和控制申请文件里通常提供的信息中已有明确的核心特征,这些特征在所有的生物仿制药申请中也都需要(例如关于聚集、杂质等信息),但是还有有几条路可以实现生物仿制药的简化批准,尤其是免去进行临床试验。因此,答案依实际情况的不同而不同。如果一种药物的生物化学、生物物理和生物学数据(结构和功能分析)可以证明原研药(又称为对照品)及其仿制药是相同的(或足够相似)并且剂型、容器密闭系统以及处理和管理的差异不带来任何改变,也就是说等效临床表现(药代动力学/药效动力学)可以得到保证,那么要批准生物仿制药,少量临床试验(甚至无临床试验)也就足够了。

使得监管机构能够就生物仿制药的批准需要什么条件一事作出清晰和准确的决策的重要特征有赖于递交一份关于该分子的耐用而全面的结构和功能分析数据包。这样的一份数据包需要提供比申请原研药通常所需的更多的信息。在声明要求更多信息时,监管机构参考了基于最先进的、正确可靠的正交方法和指纹方法,尽管尚未证实(甚或很难证实)。

对生物制品,要证明两次不同的生产批次所生产的产品完全相同几乎是不可能的。即使是原研公司也无法在不同批次之间生产出与其自身的生物制品完全相同的产品,这是由这些分子内在复杂性水平和合成方式所决定的。生物制品的生产者能做到最好的就是显示出生产过程的一致性,其属性介于监管机构同意的可接受的规定标准范围内,这些规定是通过长期的测试和表征得到的。这些关于原研药的历史信息是生物仿制药开发者无法获知的。但是,由于原研药生产商会向监管机构提交申请资料和历史数据,又称为"现有知识",监管机构是拥有这些信息或大部分的信息的。这些现有知识可能包括独特的生物化学、生物物理、生物学数据,甚至还可能包括毒理学和临床(包括PK/PD和免疫原性)数据,除了正常标准申请所需的以外,这些数据仿制药的开发者可能并没有意识到。因为,为了降低生物仿制药的开发时间和费用,以及最优化地使用FDA资源,生物仿制药的开发者和FDA之间需要有一种新的交互模式。在这种模式中,生物仿制药的开发者和FDA会有早期、有效和活跃的对话(又称为步进式的方法)来理解这个"一揽子证据"数据包应包括什么,尤其是涉及理解需要何种类型的毒理学和临床数据。即使在一种生物仿制药获批后,还需要进行药物警戒试验以减轻与原研药相比生物仿制药的任何额外的潜在未知风险。

最后,FDA文件指出生物仿制药要达到一定程度的等同性,临床试验(就临床表现和免疫原性而言)必不可少,其临床试验的结果要和原研药的实验结果被认为足够相似它们之间才是"可互换的"。这种可互换性可以通过以下方法确立:在生物仿制药批准前进行临床试验,在批准后进行额外的临床试验,或通过可能的药物警戒试验。应该注意到,截至目前,FDA和欧洲药品管理局(EMA)都没有对可互换性提供一个清晰的定义和指南草案(参见参考资料2中FDA对可互换性的陈述)。

参考资料2:美国生物仿制药申请通道草案概述

下图总结了美国食品药品管理局发布的指南草案中的关键点,该草案旨在为美国开发生物仿制药获批通道做起始的准备。该过程的关键点如下所列。

a:由于该过程的独特性,FDA提出了一种步进式的方法,这种方法涉及生物仿制药开发者与FDA之间实质性的相互接触。

b:部分独特性取决于原研药的现有知识水平。

c:该过程另一部分的独特性体现在评估生物仿制药和原研药(又称对照品)之间的可比性或生物相似度(通常又称为"是高度相似的")。进行这项评估时,应该使用若干次不同批次所生产的生物仿制药和对照品,以利于了解生物仿制药和原研药相关数据的空间变异性。

d:在生物仿制药批准过程中第一项重要的实验步骤是评估生物仿制药和对照品之间结构上和功能上的可比性。在进行这项评估时,FDA强调了增加使用"正交方法"和"指纹样方法"。这些方法可能代表了更先进、更新型的分析表征方法,虽然尚未获得证实但在科学上肯定是正确合理的。生物仿制药的开发者应该认识到这个阶段使用的比较方法越昂贵、越广泛、越耐用,需要进行动物研究(毒性测试)和临床试验(人体试验)的可能性就越低(参见下文)。

e:使用现有知识和d步所得的结果,需要获得的毒性和临床数据的程度即可被评估和确定。至少,需要提供药代动力学/药效动力学(PK/PD)和免疫原性数据以支持生物相似性;然而,根据现有知识(b步骤)和d步骤所得的结果,更广泛的毒性测试和/或临床试验也可能还是需要的,尤其是针对解决生物相似性中残基不确定性的需要。

f:生物相似性,据FDA的定义,指的是:"生物制品与对照品高度相似,尽管在临床无活性组分上有小的差异。。。就安全、纯度和效价而言,生物仿制药产品和对照品之间不存在任何临床上有显著意义的差异。"在进行这项评估时,生物仿制药的开发者需要认识到评估是建立在个案的基础上的。

g:生物相似性的一个更高的标准被定义为"可互换性"。尽管FDA对这一属性并没有作出清晰的定义,但它确实说过"申请者必须提供足够的信息以证明生物相似性,以及证明该生物制品可被预计会在任何一位患者身上产生和对照品一样的临床结果,如果该生物制品对一个个体给药次数超过一次,交替使用生物仿制药和对照品或者从使用其中的一种转换至另一种的情况下,安全性方面的风险或者减弱的效能不大于仅仅使用对照品而没有交替或转换情况下的风险(参看公共保健服务法(PHS)第351(i)(3)节)。"

h:在被批准为一种生物仿制药或可在可互换状态下使用的生物仿制药后,药物警戒程序需要到位以确保生物仿制药治疗蛋白产品的安全性和有效性,尤其是在向公众推介的初期。

参考资料3:现有表征指南及与可比性研究的关系

可能现有的行业标准中与决定生物药物可比性最相关的就是国际协调会议(ICH)的三方协调指南,又称为Q5E(生物技术产品/生物制品在工艺变更时的可比性),由ICH工作组于2004年11月发布。这些指南的制定是为了帮助生物药物产品的开发者建立工艺变更前后产品间的内在可比性,以便于为其产品执行工艺变更。这些指南关注了四个主要的标准,这在Q5E的2.2.2节有描述:

生理化学性质(定义在ICH的Q6B)

ICH
Q6B指南所涉及的生理化学性质涵盖对分子实体的比较以确定分子间的一致性/差异性水平。高级结构的分析是值得推荐的,包括二级、三级和四级结构的任何改变的评估。专门的指南在ICH
Q6B文件中有描述。如果无法获得高级结构信息,我们建议进行相关的生物学试验以证实或支持两种产品构象等效。

生物活性

我们鼓励生产者提供有意义的和有远见的生物试验数据以强调或确认工艺改变不产生任何影响。这些试验也可以在某些情况下作为高级结构确认的替代方法。当理化性质或生物学试验不足以证明两种产品的高级结构是相同的,非临床和临床试验还是必须的。

免疫化学性质

对于抗体和抗体相关产品,其生产者应通过特定的试验证明这两种产品的特定属性被保持了并且/或者是可比的。考虑到已确定糖基化和/或去糖基化会导致免疫原性后果,在生物仿制药和可互换的生物制品指南的建立过程中,这些问题吸引了大量的注意力。

纯度、杂质和污染物

纯度、杂质和污染物方面的指南的目的是确保不同亚型和降解产物均被检测到,规定结合使用多种分析方法,以证明产品的纯度概况没有发生改变。生产商应该保证将会采取措施防止污染物的形成,将会通过恰当的方法识别和表征工艺中发现的任何污染物。

本文翻译自 Analytical tools for characterizing biopharmaceuticals and
the implications for biosimilars







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