蛋白质组学

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E、磷酸化位点的确定 找到磷酸肽后,串联质谱子离子扫描模式对磷酸肽进行序列分析。 F、磷酸化定量分析 1、N稳定同位素标记法: N培养基 14 15 N培养基 14 2、同位素亲和标记法 细胞池1 细胞池2 混合 β消除+氘 Β消除+氢 亲和纯化 酶解 MS 磷酸肽或磷酸化蛋白在缄性环境下发生β消除,同时用亲核试剂攻击形成的双键并发生加成反应,亲核试剂一种为氘原子、一种为氢原子,再接上一个亲和标签(如生物素biotin),混合酶解,提取含biotin的肽段进行MS检测。 六、糖基化蛋白的鉴定 A、用糖甙内切酶切断糖链与蛋白链间的糖甘键,将反应前后的质谱图比较,可知糖链的平均质量。 B、糖基化位点的确定 先用蛋白酶酶解成含糖链和不含糖链的肽段,获得其肽质量指纹谱,再用糖苷内切酶切除糖链,其肽质量指纹谱将发生变化,含糖肽段发生丢失位移,通过网上数据库检索其序列,找到位点。 C、用凝集素直接提取含糖肽段,再结合质谱技术分析 凝集素对含糖肽段有专一亲和性 七、质谱在蛋白质组学中的应用 A、稳定同位素代谢标记技术。前面已介绍 B、同位素亲和标签技术 ICAT 专一与Cys共价结合 优缺点 优点 1、兼容分析任何条件下的体液、细胞、组织中的绝大部分蛋白。 2、烷化反应在盐、去垢剂/稳定剂(如SDS、尿素盐酸胍等)存在下都可进行。 3、只分析含Cys残基的肽段,降低分析复杂性。 缺点 ICAT本身分子量较大(500Da左右)增加数据检索复杂性。 无法分析不含Cys的蛋白。 2DLC-MS的基本原理 Why 2D LC/MS? 可鉴定极端具有pI、疏水性、分子量的蛋白质 适合膜蛋白 重复性好 容易自动化 上样量大 高灵敏度(溶液酶切) 可根据样品灵活配置(但最后一维一般为RP) Then why SCX/RP/MS? SCX和RP的分离原理是互补的 SCX按荷电情况,PR按疏水性 流动相是兼容的 pH?3,ACN/water/salt SCX流动相中的盐可以在RP时有效去除 Tryptic peptides 在SCX柱上可以有效保留 Tryptic peptides在SCX条件下是稳定的 Separation powerPeak capacities 2DE ~500 - 10,000 protein spots Affinity Chromatography 2 Ion exchange Chromatography 10protein level Gelfiltration 10 Reversed Phase Chromatography~50 Ion Exchange Chromatography ~25 Reversed Phase Chromatography ~100peptide level 2DLC (IEX/RPC)~2,500 Linear IT MSn~18,000 mph* *measurements per hour MS/MS MS Gel Gel spot Proteolytic peptides Mixture of Proteins Digestion Proteolytic peptides Digestion LC Protein Identification Workflows Peak Finding Peak list Search of a Sequence Collection Identified and Proteins Protein Candidates Significance Testing Protein Function? Sequence Similarity Search RPC IEX RPC trap RPC trap on-line elution by salt plugs to trap column IEX off-line gradient elution with “classical”fraction collection RPC 2D LC的三种配置形式 IEX RPC in-line MudPIT on-line 2D-LC 优点 全自动 样品体积可根据后续RPC调整 在线脱盐、浓缩 自由选择缓冲盐 缺点 SCX峰容量有限 ACN浓度在IEX和RPC得一致 两相分离都没能在最佳状态下进行 RPC IEX RPC trap RPC trap off-line SCX with fraction collection 优点 两维分离都有可能在最佳状态下进行,得到最好分辨率和






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