蛋白质组学

蛋白质质谱分析技术和分析方法

蛋白质质谱分析要求溶液或固态蛋白质在注入加速电场或磁场中进行分析之前,必须先在气相中将他们转变成离子化形式。蛋白质电离的两种主要方法是电喷雾电离(ESI)和基质辅助激光解吸/电离(MALDI)。在电喷雾中,离子是由溶液中的蛋白质产生的,它使易碎的分子完整地电离,有时保留非共价相互作用。在MALDI中,蛋白质通常以固体形式嵌入基质中,而离子是由激光脉冲产生的。电喷雾比MALDI产生的多电荷离子更多,从而可以测量高质量蛋白质以及更好地识别碎片,而MALDI速度更快且受污染物、缓冲液和添加剂的影响较小。

全蛋白质量分析的首选仪器是飞行时间(TOF)质谱或傅立叶变换离子回旋共振(FT-ICR)因为它们的质量可测范围宽,并且在FT-ICR的情况下,其质量精度很高。蛋白质的电喷雾离子化通常会产生800 m / z 2000的多个带电物,并且可以使用TOF或离子阱仪器对卷积的光谱进行反卷积,以确保蛋白质的平均质量在50 ppm或更佳。

蛋白水解肽质量分析是一种常用的蛋白质表征方法。只要将完整蛋白质分解成较小的肽片段,样品制备就会更加容易。肽质量分析中最广泛使用的仪器是MALDI-TOF,它们可以高速采集肽质量指纹(PMF)(可以在大约10秒内分析1 PMF)。多级四极杆飞行时间和四极杆离子阱也可用于该应用。

肽色谱跟踪和MS/MS图谱

串联质谱(MS/MS)用于测量碎片质谱和鉴定蛋白质,速度快且准确度高。碰撞诱导解离在主流应用中用于从特定的肽离子中生成一组片段。断裂过程主要产生沿肽键断裂的裂解产物。由于片段化性质简单,可以使用观察到的片段质量与许多给定肽序列之一的预测质量数据库匹配。

分析方法

为了与可用质谱仪的性能和质量范围保持一致,这里使用两种方法来表征蛋白质。首先,通过上述两种技术中的一种将完整的蛋白质离子化,使用质量分析仪进行分析,这种方法被称为蛋白质分析的“自上而下”策略。但是,由于处理的是整个蛋白质,加上蛋白质的异质性和分析的复杂性,自上而下的方法主要限于低通量单蛋白质研究。

第二种方法称为“自下而上”质谱法。使用蛋白酶(例如胰蛋白酶)将蛋白质酶解为较小的肽,随后,利用质谱仪并通过肽质谱指纹图谱或串联质谱法进行鉴定,因此,这种方法是在肽水平上来鉴定推断蛋白质。与完整蛋白质相比,这种更小且更均匀的片段更易于分析,并能提高鉴定的精确度。所以,这种“自下而上”的方法是蛋白质组学研究的首选方法。还有一种方法是“自中而下”法,这种方法分析适用于比典型胰蛋白酶肽更大的蛋白水解肽。

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