蛋白质组学

基于MS/MS的数据非依赖法非标记定量蛋白质组学蛋白质互作分析(二)

随着混合技术的发展,SRM测量在蛋白质组学中的使用更为广泛。混合技术可以从SRM信号中获取高质量的MS/MS光谱。混合质谱扫描方法的结合提供了以高置信度进行测量的能力,能够对大量蛋白质进行定量分析。这些研究都表明,SRM提供的测量结果在一系列样本和较长时间内都是一致且精确的。在采用SRM作为稳健量化方法的关键步骤中,CPTAC对SRM分析进行了多站点验证,介绍了基于SRM的检测方法的原则和框架,并强调了在许多设施的多种仪器上运行稳健的多路复用蛋白检测的可能性,还确定了SRM方法的一些关键问题,即需要进行前期分析验证和迭代。例如,100蛋白分析的方法开发可能需要12个月以上的时间来识别正确的转换并确认分析的有效性,以确保SRM信号中没有“隐藏”干扰(图例)。

图例. SRM测量示意图。SRM选定监控的碎片离子由代表0.7AMU分离窗口的阴影框表示。高分辨率的片段离子在这些框中显示,以表示每个提取窗口中的真实离子群。左边和右边的窗口表示不受干扰的片段离子,中间的窗口表示受干扰的离子。在这种情况下,峰极有可能被卷积,导致方差比其他离子更高。

想要SRM在更多的定量蛋白质组学研究中得到应用,那么缩短分析时间就变得至关重要, SRM的快速测量能够监测足够多的肽来,能覆盖多达200种蛋白质的网络。在蛋白质互作分析中,SRM方法最适合于当相同诱饵(或一小群诱饵)和相互作用需要在多个条件下反复分析的情况。例如,Bisson等人开发了一种以关键信号支架蛋白GRB2为中心的SRM分析方法,然后将其用于分析添加生长因子后的相互作用动力学。这种SRM方法还可以在添加治疗药物和/或跨细胞系或患者样本后分析相互作用。

大多数情况下,蛋白质组学分析不需要对SRM分析结果进行验证,当需要进行靶向测定时验证就非常重要了,分析验证时间已成为选择SRM或其他测量(如光谱计数)的关键因素。SRM方法的确认和验证的核心是确保识别正确的过渡信号(峰值),并使用最适合的转换来获得最佳的LOD。这对SRM来说是一个挑战,因为测量信号来自一系列碎片质量空间,一般是0.5到0.7da(图3B),对测量的选择性有影响。由于肽片段离子具有相似的元素组成,MS/MS质量空间非常拥挤,并且具有相似Q1/母体质量的相近的洗脱物种也可能有MS/MS离子,或者在质量空间中足够接近,也会占据被设为目标的Q3/片段离子质量体积。

这些卷积信号会被记录在数据中,需要算法和统计方法来对产生的LC-MS/MS信号轨迹进行反卷积。这些问题在MS1数据中也存在,但在SRM的情况下,可以从MS/MS光谱中导出许多不同的离子信号,并通过测试以识别“干净”的LC峰,而在MS1中只有一个信号是干净的或卷积的。潜在卷积离子的识别和非卷积备选方案的选择因为需要人工处理,所以延长了SRM方法的开发时间。

文献参考:Stephen Tate,et.al, Label-free quantitative proteomics trends for protein-protein interactions, Journal of Proteomics, 2013.

本文由百泰派克生物科技整理编辑。百泰派克生物科技专注于基于质谱的蛋白质组学服务,结合亲和纯化与Label-free、SILAC或SWATH定量技术,百泰派克生物科技开发了一系列蛋白质组研究策略,其灵敏度高、重复性好,非常适合蛋白质相互作用的研究。







(0)

热评文章

发表评论