蛋白质组学

科普 | ESI串联质谱在蛋白质鉴定中的应用

从肽串联质谱图中鉴定出蛋白质的方法有两种,首先是对太谱图进行从头解析,以获得肽序列,然后根据序列数据库对序列进行BLAST搜索来鉴定蛋白质。在只需要处理几个谱图的情况下,用这种方法非常适合。根据谱图的复杂性和分析人员的经验,手动从头解析单个MS-MS谱图需要半小时到几天的时间。但是,有些谱图包含的b-或y-离子系列是不完整的,因此想要从这些谱图中清楚地解析肽序列不太可能。那么,分析者就必须对谱图线索不足的序列进行猜测,这就很考验执行该项MS-MS质谱从头解析人员的技巧和经验了。尽管如此,我们还是可以轻易地利用这种方法,在一到两天时间内对样品中的几个多肽的序列进行排序,并通过BLAST搜索鉴定出前体蛋白。因此,这个方法在某些情况下还是非常适用的,例如从SDS凝胶条带中鉴定出一到两个蛋白质。

然而,蛋白质组学的新兴领域依赖的就是能从MS-MS谱图中识别出大量的蛋白质。显然,从头测序/BLAST搜索法对于大规模的蛋白质鉴定来说太慢了。这种慢方法使用的是手动检查MS-MS谱图来确定肽序列的。这也是利用MS-MS谱图数据进行蛋白质鉴定的第二种方法的优势所在。

蛋白质鉴定的第二种方法不需要手动从头序列解析。在该方法中,算法被直接用于关联质谱数据和数据库中的肽序列,不需要分别解析每个谱图。这种方法的一个很重要的点是我们需要甄别该方法与由基因组测序带来的新兴数据库资源的匹配程度。我们已知一个算法可以通过匹配肽质谱图和数据库序列来鉴定蛋白质,那么这种方法的唯一限制就是质谱的质量和数据库的完整性和准确性。

如果我们获得的MS-MS肽谱图的肽序列存在于数据库中,那么正确的算法应该能够进行匹配。下面简单介绍几种从MS-MS质谱数据中鉴定蛋白质的算法/软件。

Sequest

Sequest(Eng等人,1994年)是第一个通过将MS-MS肽谱图与数据库序列相匹配来鉴定蛋白质的算法/软件应用程序。Sequest将肽的不间断串联质谱与来自蛋白质数据库的氨基酸序列相关联。它不仅将每个串联质谱连接到一个蛋白质,而且还连接到合成该蛋白质的有机体。Sequest使用两种评分函数。第一种方法用于快速确定每个谱图的几百种候选肽(初步评分,Sp),第二种方法使用实验和理论谱图的互相关(Xcorr)。初步评分考虑了匹配片离子强度的总和、总碎片离子和匹配碎片离子的数量,以及奖励每个离子系列(b和y离子)匹配连续性的因素。最终的分数是通过将任意数据库肽段预测的片段离子的预期质量转化为一个理论谱,并通过计算理论谱和实验谱之间的相互关系来实现的。

The MS-Tag Program

将质谱数据与肽序列的理论质谱数据进行比较的一般方法可用于其他算法和软件工具。MS-Tag Program(http://prospector.ucsf.edu)最初开发来用于分析肽MALDI-TOF分析(如图2.)中获得的PSD谱图,但已经过修改以适应不同类型仪器的MS-MS数据。用户可以从待分析的MS-MS谱图中输入m/z值列表、前体离子的m/z值和电荷状态、关于用于蛋白质水解消化的酶类型的信息以及用于获取MS-MS数据的仪器的信息。该算法预先过滤数据库中与所分析的质谱前体m/z相匹配的肽。输出的结果提供了匹配肽和片段的列表,与实际MS-MS谱图中记录的离子相匹配。MS-Tag特别适合于分析MALDI-TOF PSD谱图。

 

MALDI-TOF质谱分析一般流程(百泰派克生物科技)

The Mascot Program

Mascot Program(http://www.matrixscience.com/)使用基于概率的MOWSE算法、前体m/z信息和MS-MS片段离子数据从数据库中鉴定蛋白质。Mascot实际上是一组程序,可用于肽质量指纹以及MS-MS数据分析。借助Mascot Program网站上提供的转换程序,可实现从LC-MS-MS数据文件自动输入多个MS-MS谱图。

上面介绍到的几种算法可以将MS-MS数据与蛋白质序列或翻译成蛋白质序列的核苷酸(例如基因组或EST)序列相匹配。如果数据库中不存在所分析的肽的序列,则无法进行正确匹配。人类和其他生物基因组测序的进展使这些数据库日趋完精确完整。在不久的将来,我们也许能获得生物体内所有基因的完整蛋白质序列数据库。这一新兴的数据库信息为分析蛋白质组学方法提供了越来越强大的支持和依靠。

本文由百泰派克生物科技整理编辑,转载请注明出处。

百泰派克生物科技采用超高分辨率质谱技术,基于Thermo Fisher公司的Q Exactive质谱仪、LTQ Orbitrap Elite质谱仪、Orbitrap Fusion™ Lumos™ Tribrid™ 质谱仪等,结合 Nano-LC液相色谱技术,能够对蛋白质提取物、SDS-PAGE蛋白条带、2D蛋白胶点、pull-down及co-IP等样品中的蛋白质进行高效精准的蛋白质谱鉴定。







(0)

热评文章

发表评论