蛋白质组学

质谱分析在化学分析中的应用

今天推送的主要内容有——

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一 概述

二 质谱分析技术基础理论

三 质谱分析技术在化学分析中的应用

下面,让我们开始吧!

一 概述

质谱(mass spectrometry,MS)的开发历史要追溯到 20 世纪初,最初的质谱仪主要用来测定元素或同位素的原子量,随着离子光学理论的发展,质谱仪不断改进,其应用范围也在不断扩大,到 20 世纪 50 年代后期已广泛地应用于无机化合物和有机化合物的测定。进入 80 年代后,材料学、精密机械、电真空和计算机等新兴学科和技术的发展,促进了高性能质谱仪器制造业的进步。现今,质谱分析技术已经大量应用到化学分析测试中。

二 质谱分析技术基础理论

(一) 质谱分析法原理

质谱分析法是通过应用质谱仪将被测物质离子化,按离子的质荷比分离,测量各种离子谱峰的强度而实现分析目的的一种分析方法。质量是物质的固有特征之一,不同的物质有不同的质量谱即质谱,利用这一性质,可以进行定性分析(包括分子质量和相关结构信息);而应用谱峰强度与它代表的化合物含量关系可进行定量分析。

(二) 质谱仪的组成

质谱仪一般由真空系统、进样系统、离子源、质量分析器、检测器、数据处理系统六部分组成,图 1 为质谱仪的结构示意图。

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1 质谱仪的性能指标

衡量一台质谱仪性能好坏的指标很多。这些指标包括分辨率,质量范围,灵敏度,质量稳定性、质量精度等。质谱仪的种类很多,其性能指标的表示方法也不完全相同,现将主要的指标说明如下。

1.1 分辨率

质谱仪的分辨率表示质谱仪把相邻两个质量分开的能力。常用 R 表示。其定义是,如果某质谱仪在质量 M 处刚刚能分开 M 和 M+?M 两个质量的离子。则该质谱仪的分辨率为 R=M/ ? M。

1.2 质量范围

质量范围是质谱仪所能测定的离子质荷比的范围。对于多数离子源,电离得到的离子为单电荷离子。这样,质量范围实际上就是可以测定的分子量范围;对于电喷雾源,由于形成的离子带有多电荷,尽管质量范围只有几千,但可以测定的分子量可达 10 万以上。质量范围的大小取决于质量分析器。四极杆分析器的质量范围上限一般在 1000 左右,也有的可达 3000,而飞行时间质量分析器可达几十万。由于质量分离的原理不同,不同的分析器有不同的质量范围。彼此间比较没任何意义。同类型分析器则在一定程度上反映质谱仪的性能。

1.3 灵敏度

灵敏度表示一定的样品,在一定的分辨率下,产生一定信噪比的分子离子峰所需的样品量。

1.4 质量稳定性

质量稳定性主要是指仪器在工作时质量稳定的情况,通常用一定时间内质量漂移的质量单位来表示。例如某仪器的质量稳定性为:0.1amu/12hr,意思是该仪器在 12 小时之内,质量漂移不超过0.1amu。

1.5 质量精度

质量精度是指质量测定的精确程度。常用相对百分比表示。质量精度是高分辨质谱仪的一项重要指标,对低分辨质谱仪没有太大意义。

2 串联质谱及应用技术

2.1 串联质谱

两个或更多的质谱连接在一起,称为串联质谱。最简单的串联质谱(MS/MS)由两个质谱串联而成,其中第一个质量分析器(MS1)将离子预分离或加能量修饰,由第二级质量分析器(MS2)分析结果。MS/MS 最基本的功能包括能说明 MS1 中的母离子和 MS2 中的子离子间的联系。

MS/MS 在混合物分析中有很多优势。在质谱与气相色谱或液相色谱联用时,即使色谱未能将物质完全分离,也可以进行鉴定。MS/MS 可从样品中选择母离子进行分析,而不受其他物质干扰。

2.2 联用技术

色谱可作为质谱的样品导入装置,并对样品进行初步分离纯化,因此色谱/质谱联用技术可对复杂体系进行分离分析。因为色谱可得到化合物的保留时间,质谱可给出化合物的分子量和结构信息,故对复杂体系或混合物中化合物的鉴别和测定非常有效。

三 质谱分析技术在化学分析中的应用

(一) 质谱定性分析

一张化合物的质谱包含着有关化合物的很丰富的信息。在很多情况下,仅依靠质谱就可以确定化合物的分子量、分子式和分子结构。而且,质谱分析的样品用量极微,因此,质谱法是进行有机物鉴定的有力工具。当然,对于复杂的有机化合物的定性,还要借助于红外光谱,紫外光谱,核磁共振等分析方法。

1 相对分子质量的测定

分子离子的质荷比就是化合物的分子量。因此,在解释质谱时首先要确定分子离子峰,在判断分子离子峰时要综合考虑样品来源,性质等其他因素。如果经判断没有分子离子峰或分子离子峰不能确定,则需要采取其它方法得到分子离子峰。

2 化学式的确定

利用一般的 EI 质谱很难确定分子式。在早期,曾经有人利用分子离子峰的同位素峰来确定分子组成式。有机化合物分子都是由 C、H、O、N 等元素组成的,这些元素大多具有同位素,由于同位素的贡献,质谱中除了有质量为 M 的分子离子峰外,还有质量为 M+1,M+2 的同位素峰。由于不同分子的元素组成不同,不同化合物的同位素丰度也不同,贝农(Beynon)将各种化合物(包括 C,H,O,N 的各种组合)的 M、M+1、M+2 的强度值编成质量与丰度表,如果知道了化合物的分子量和 M、M+1、M+2 的强度比,即可查表确定分子式。例如,某化合物分子量为 M=150(丰度 100%)。 M+1 的丰度为 9.9%,M+2 的丰度为 0.88%,求化合物的分子式。根据 Beynon 表可知,M=150 化合物有 29 个,其中与所给数据相符的为 C9H10O2。这种确定分子式的方法要求同位素峰的测定十分准确。而且只适用于分子量较小,分子离子峰较强的化合物,如果是这样的质谱图,利用计算机进行库检索得到的结果一般都比较好,不需再计算同位素峰和查表。因此,这种查表的方法已经不再使用。表 1 是常见元素的同位素丰度表。

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利用高分辨质谱仪可以提供分子组成式。因为碳、氢、氧、氮的原子量分别为 12.000000,10.07825,15.994914,14.003074,如果能精确测定化合物的分子量,可以由计算机轻而易举的计算出所含不同元素的个数。目前傅立叶变换质谱仪、双聚焦质谱仪、飞行时间质谱仪等都能给出化合物的元素组成。

3 结构鉴定

纯物质结构鉴定是质谱最成功的应用领域,通过对谱图中各碎片离子、亚稳离子、分子离子的化学式、m/z 相对峰高等信息,根据各类化合物的分裂规律,找出各碎片离子产生的途径,从而拼凑出整个分子结构。根据质谱图拼出来的结构,对照其他分析方法,得出可靠的结果。

另一种方法就是与相同条件下获得的已知物质标准图谱比较来确认样品分子的结构。

(二)质谱定量分析

1 同位素测量

分子的同位素标记对有机化学和生命化学领域中化学机理和动力学研究十分重要,而进行这一研究前必须测定标记同位素的量,质谱法是常用的方法之一。如确定氘代苯 C6D6。的纯度,通常、可用 C6D6+与 C6D5H+、C6D6H2+等分子离子峰的相对强度来进行。对其他涉及标记同位素探针、同位素稀释及同位素年代测定工作都可以用同位素离子峰来进行。

2 无机痕量分析

火花源的发展使质谱法可应用于无机固体分析,成为金属合金、矿物等分析的重要方法,它能分析周期表中几乎所有元素,灵敏度极高,可检出或半定量测定 10-9 范围内浓度。由于其谱图简单且各元素谱线强度大致相当,应用十分方便。

电感耦合等离子光源引入质谱后(ICP-MS),有效地克服了火花源的不稳定、重现性差、离子流随时间变化等缺点,使其在无机痕量分析中得到了广泛的应用,ICP-MS 是国际公认的物质量的准确测量方法之一,尤其对于复杂基体样品中痕量成分的准确测量。

与此同时,二次离子质谱和同位素稀释质谱在研究和应用过程中,采用了多种新技术和新工艺,方法的灵敏度、精密度有了显着改善。这些新、老方法的结合,形成了比较完善的分析方法和测试体系。

3 混合物的定量分析

利用质谱峰可进行各种混合物组分分析,在进行分析的过程中,保持通过质谱仪的总离子流恒定,以使用于得到每张质谱或标样的量为固定值,记录样品和样品中所有组分的标样的质谱图,选择混合物中每个组分的一个共有的峰,样品的峰高假设为各组分这个特定 m/z 峰峰高之和,从各组分标样中测得这个组分的峰高,解数个联立方程,以求得各组分浓度。

用上述方法进行多组分分析时费时费力且易引入计算及测量误差,故现在一般采用将复杂组分分离后再引入质谱仪中进行分析,常用的分离方法是色谱法。

(1) 气相色谱/质谱联用(GC-MS)定量分析

由 GC-MS 得到的总离子色谱图或质量色谱图,其色谱峰面积与相应组分的含量成正比,若对某一组份进行定量测定,可以采用色谱分析法中的归一化法、外标法、内标法等不同方法进行。这时,GC-MS 法可以理解为将质谱仪作为色谱仪的检测器。其余均与色谱法相同。与色谱法定量不同的是,GC-MS 法可以利用总离子色谱图进行定量之外,还可以利用质量色谱图进行定量。这样可以最大限度的去除其它组份干扰。

为了提高检测灵敏度和减少其它组分的干扰,在 GC-MS 定量分析中质谱仪经常采用选择离子扫描方式。对于待测组分,可以选择一个或几个特征离子,而相邻组份不存在这些离子。这样得到的色谱图,待测组份就不存在干扰,同时有很高的灵敏度。用选择离子得到的色谱图进行定量分析,具体分析方法与质量色谱图类似。但其灵敏度比利用质量色谱图会高一些,这是 GC-MS 定量分析中常采用的方法。

(2) 液相色谱/质谱联用(LC/MS)分析方法

LC-MS 分析得到的质谱过于简单,结构信息少,进行定性分析比较困难,主要依靠标准样品定性,对于多数样品,保留时间相同,子离子谱也相同,即可定性,少数同分异构体例外。

用 LC-MS 进行定量分析,其基本方法与普通液相色谱法相同。即通过色谱峰面积和校正因子(或标样)进行定量。但由于色谱分离方面的问题,一个色谱峰可能包含几种不同的组份,给定量分析造成误差。因此,对于 LC-MS 定量分析,不采用总离子色谱图,而是采用与待测组分相对应的特征离子得到的质量色谱图或多离子监测色谱图,此时,不相关的组分将不出峰,这样可以减少组份间的互相干扰,LC-MS 所分析的经常是体系十分复杂的样品,样品中有大量的保留时间相同、分子量也相同的干扰组分存在。为了消除其干扰,LC-MS 定量的最好办法是采用串联质谱的多反应监测(MRM)技术。即,对质量为 m1 的待测组份做子离子谱,从子离子谱中选择一个特征离子 m2。正式分析样品时,第一级质谱选定 m1,经碰撞活化后,第二级质谱选定 m2。只有同时具有 m1 和 m2 特征质量的离子才被记录。这样得到的色谱图就进行了三次选择:LC 选择了组份的保留时间,第一级 MS 选择了 m1,第二级 MS 选择了 m2,这样得到的色谱峰可以认为不再有任何干扰。然后,根据色谱峰面积,采用外标法或内标法进行定量分析。此方法适用于待测组份合量低,体系组份复杂且干扰严重的样品分析。

(三)质谱图解析

1 质谱图和质谱表

质谱图是指化合物分子被离子化后,由离子的质荷比与其相对丰度构成的谱图,习惯上称为棒图(bar graph)。图 8 为 正十二烷质谱图,横坐标表示离子的质荷比(m/z),纵坐标表示离子的相对丰度。丰度最大的离子峰称基峰;在质谱分析中,规定基峰的丰度为 100,其他离子峰的丰度为其与基峰丰度的比值。

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质谱图表达质谱的信息简洁、直观,但质荷比、丰度的表达不够细致、准确,进行谱图解析时就显出不足。因此质谱也常用表格方式表述,见表 2 未知物质谱。

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2 质谱图解析流程

(1) 解析分子离子区

a) 标出各峰的质荷比数,尤其注意高质荷比区的峰。

b) 识别分子离子峰。

c) 分析同位素峰簇的相对强度比及峰与峰间的 Dm 值,判断化合物是否含有 C1、Br、S、 Si 等元素及 F、P、I 等无同位素的元素。

d) 推导分子式,计算不饱和度。由高分辨质谱仪测得的精确分子量或由同位素峰簇的相对强度计算分子式。

e)由分子离子峰的相对强度了解分子结构的信息。分子离子峰的相对强度由分子的结构所决定,结构稳定性大,相对强度就大。

(2)解析碎片离子

a)由特征离子峰及丢失的中性碎片了解可能的结构信息。

b)综合分析以上得到的信息,结合分子式及不饱和度,提出化合物的可能结构。

c)分析所推导的可能结构的裂解激励,看其是否与质谱图相符,确定其结构,并进一步解释质谱,或与标准谱图比较,或与其他分析光谱配合,确证结构。

(文章化学分析计量)







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