蛋白质组学

多方合作在Cell上发表整合蛋白基因组揭示儿童脑瘤背后的通路研究

儿童脑瘤(pediatric brain tumors)是幼儿癌症中致死率较高的癌症,尽管基因组学研究已经揭示了儿童脑瘤的部分机制,但是由于儿童脑瘤的基因组具有低突变性(low mutational burden)等特点,仅仅依靠基因组学,或者转录组学数据,无法准确的定位其背后的生物学通路。

近日,由美国临床肿瘤蛋白质组分析协会(Clinical Proteomic Tumor Analysis Consortium,CPTAC)牵头的多个课题组在Cell上联合发表了整合蛋白基因组数据(Integrated Proteogenomic )对儿童脑瘤的不同病理分型进行研究的论文,该论文为第一篇针对儿童脑瘤进行大规模蛋白基因组表征的论文,为疾病分型,肿瘤微环境研究,潜在的药物靶点研究等提供了新的思路(1)。

在该论文中,作者展示了完整的蛋白基因组工作流程。首先使用全基因组测序,RNA测序,蛋白质TMT定量(完整蛋白质组和磷酸化蛋白质组),蛋白质MRM定量技术对临床上7种基于病理的分型进行分析。这7种分型包括低程度胶质瘤(low-grade glioma, LGG),室管膜瘤(ependymoma, EP),高程度胶质瘤(high-grade glioma, HGG), 髓母细胞瘤 (medulloblastoma, MB),神经节胶质瘤(ganglioglioma),颅咽管瘤(craniopharyngioma, CP)以及横纹肌样瘤(atypical teratoid rhabdoid tumor, ATRT)。

实验中共收集到7种分型共218例组织样本,由于样品的稀有性和磷酸化修饰的特性,需要有高通量和高准确性的方法快速对样品进行分析,因此作者选择了11标TMT标记技术。在11标TMT技术中,作者选择前10个通道对单个样品进行标记,然后选择第11个通道作为参考通道(Bridge channel),用于保证实验质量,随后一针进样即可完成定性和定量分析。随后进过常规样品制备和磷酸样样品富集后,作者使用11标TMT技术对全蛋白和磷酸化蛋白质进行定性和定量分析。

实验数据经过QC过滤,定性定量分析后,218例样本共鉴定并定量出8802个蛋白质(平均鉴定数5122)和18235个磷酸化位点(平均鉴定数2714)。随后作者使用蛋白质组学数据进行非监督聚类分析,共生成8个分型(C1-C8)。

将基于蛋白质组、转录组与基于病理特征的分型相比(图1.a),部分分型高度重合(EP和MB),其余分型重合度不高。值得注意的是基于蛋白质组的分型中的C4和C8,他们大致对应病理分型中的CP分型。根据已有的报道,基因CTNNB1上的突变是CP分型的重要因素,而在该次实验中,CTNNB1突变与C4和C8分型关联不大;根据蛋白组数据,C4分型与病理分型中的LGG分型更为相似。根据蛋白质分型,可以将LGG细分为2个亚型。更为重要的是,根据基因组学分析结果,CP分型关联至下游的磷酸化激酶(MEK/ERK/AKT)的上调,而根据磷酸化蛋白数据,C4分型的磷酸化激酶也呈上调趋势。

值得注意的是,在该次实验中,RNA数据和全蛋白数据的上调因子中,均没有磷酸化激酶;只有磷酸化蛋白质数据中,磷酸化激酶(AKT1)显著上调,提示了磷酸化蛋白质组学数据的重要性(图1.b)。磷酸化激酶是针对CP分型药物的作用靶点,之前CP分型的针对性药物只针对CTNNB1突变病例,并不推荐给其他病人;而根据磷酸化蛋白质数据,部分C4分型的病例,虽然不存在CTNNB1突变,但磷酸化激酶的表现与CP分型抑制,因此也可适用于针对CP分型的药物。

图1 | a、病理分型与蛋白质组分型与RNA、蛋白质、磷酸化蛋白质的相关性

b、RNA、全蛋白质组、磷酸化蛋白质组中的显著性差异的因子

为了验证该推论,作者选取了磷酸化通路(MEK/ERK)中部分关键蛋白质作为标志物,使用质谱MRM定量方法对样本中的磷酸化蛋白质进行靶向定量(图2)。可以看出,MRM结果验证了C4分型的磷酸化激酶存在显著性变化,而AUC结果则提示,磷酸化蛋白质MRM定量可以作为临床分型的准确依据。

图2 | 部分MEK/ERK通路中关键磷酸化蛋白质的MRM定量结果

随后作者利用整合的数据,对不同亚型的肿瘤微环境进行分型,并与蛋白质组数据进行比较。同时比较了上游基因突变结果和拷贝数变化(Copy Number Variation, CNV)之间的关系,指出虽然在儿童脑瘤中,体细胞存在突变现象,但体细胞突变(somatic mutation)没有导致下游蛋白质的变化。此外,实验还揭示了磷酸化位点丰度与CNV之间的显著关联性,在TCF4, TCF25和CTNNB1基因中,RNA丰度与蛋白质/磷酸化丰度显著相关,提示蛋白质磷酸化变化在儿童脑瘤中的重要作用。

在最后的总结讨论中,作者指出尽管在目前的实际临床实践中,病理分型依然占据主流,但结合不同组学数据的分子分型具有更大的潜力。在该实验中,基于蛋白质组/磷酸化蛋白质组的分子分型,将病理上的CP分型细分为2个亚型,并且指出该亚型可以适用与之前不被推荐的靶向药物,为疾病治疗提供了新的思路。

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参考文献

F. Petralia et al., Integrated Proteogenomic Characterization across Major Histological Types of Pediatric Brain Cancer. Cell,  (2020).

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