蛋白质组学

免疫沉淀和免疫印迹

 

   在细胞生物学研究中,有时要对细胞膜分子、胞内分子或表达产物进行定性或/和定量。但由于靶蛋白表达水乎不太高,用细胞裂解液或表达上清进行SDS-PAGE电泳、免疫印迹(Western blot)检测很难达到实验目的。为此可用特异性识别靶蛋白的抗体进行免疫沉淀,纯化和富集靶抗原。免疫沉淀所获得的蛋白可进行SDS-PAGE电泳,经考马氏亮蓝染色或银染后观察目的蛋白条带。如果免疫沉淀得到的目的蛋白量低于考马氏亮蓝染色或银染的检测下限,可采用 Western blot检测方法,提高检测的灵敏度,达到实验目的。

 

 

免 疫 沉 淀

 

  (一)原理

免疫沉淀是利用抗原抗体特异性反应纯化富集目的蛋白的一种方法。抗体与细胞裂解液或表达上清中相应的蛋白结合后,再与蛋白 A/G(Protein A/G)或二抗偶联的agaose或Sepharose珠子孵育,通过离心得到珠子-蛋白A/G或二抗-抗体-目的蛋白复合物,沉淀经洗涤后,重悬于电泳上样缓冲液,煮沸5-10 min,在高温及还原剂的作用下,抗原与抗体解离,离心收集上清,上清中包括抗体、目的蛋白和少量的杂蛋白。

 

  (二)试剂

  1.PBS:8g NaCl、0.2 g KCl、1.44g Na2HPO4、0.24g KH2PO4溶于800 ml双蒸水中,用HCl调PH至7.4,在补加水至1L,高压灭菌后保存于室温。

  2.NaCl:5.8 g NaCl溶于 80 ml双蒸水中,再补加水至100 ml,高压灭菌。

  3.1 1M Tris(pH 7.5): 12.1g Tris碱,溶于80 ml双蒸水,用 HCl调 pH至7.5,再补加水至100 ml。

  4.蛋白酶抑制剂:Aprotinin和Leupeptin溶于双蒸水,PMSF溶于异丙醇,浓度均为10 mg/ml。

  5.N-40:10%(w/V)。

  6.脱氧胆酸钠:10%(w/v),溶于10 mM HEPES(pH 8.0)。

  7.细胞裂解液:50 mM Tris(pH 7.5)、150 mM NaCl、0.1 mg/ml PMSF、1 ug/ml Aprotinin、1ug/ml Leupeptin、l%NP-40、0.5%脱氧胆酸钠。

  8.稀释液:50 mM Tris(PH 7.5)、150 mM NaCl、0.1 mg/ml PMSF、1 ug/ml Aprotinin,1 ug/ml  Leupeptin、0.1%NP-40。

  9.洗涤液 Ⅰ:50 mM Tris(pH 7.5)、150 mM NaCl、0.1%NP-40。

  10.洗涤液Ⅱ:10  mM  Tris(pH 7.5)。

  11.Protein  A/G-Agarose。

12.2 SDS-PAGE电泳上样缓冲液:100 mM  Tris(pH 6.8)、200 mM DTT、4%SDS、0.2%溴酚蓝、20%甘油。

 

  (三)操作步骤

  1.离心收集细胞,PBS洗涤2次。细胞用量根据目的蛋白表达的水平而定,一般用 1 107-5 107 细胞。

  2.按 1 107 细/ml加人细胞裂解液,于冰浴上超声破碎,然后再冰浴 30 min。

  3.4℃ 12 000 g离心 10 mn,取上清。

  4.往上清中加人50 ul的蛋白 A/G-agarose,于4℃在摇床上温和摇1-3 h进行预清除。

  5.12 000转离心20 s,取上清。

  6.将上清等分成两份,补加稀释液至1ml,其中一份加人1-10 ug识别目的蛋白的抗体,另一份加人等量的对照抗体,于4℃在摇床上温和摇2 h,然后加入50 ul的蛋白A/G-Agarose于4℃在摇床上温和摇过夜。

  7.离心弃上清,用洗涤液Ⅰ洗沉淀4次,洗涤液Ⅱ洗 2次,每次洗涤于4℃在摇床上温和摇20 min。

  8.离心弃上清,用4号针头尽可能移去液体。

9.加人20-50 ul的电泳上样缓冲液,于100℃煮5-10 min,离心收集上清。上清中含有目的蛋白和抗体,可进一步用蛋白电泳和Western blot进行定性和定量。

 

  (四)注意事项

  1.不同种属来源及不同亚类的抗体与蛋白A和蛋白G的-结合力不同(表),有的甚至不能结合,如小鼠的 IgM,这类抗体不能用蛋白 A/G-agarose直接免疫沉淀。

  2.PMSF对身体有害,注意防护。

3.根据免疫沉淀的结果,洗涤液Ⅰ的盐离子浓度可作一定的调整,如果沉淀的杂蛋白较多可适当增加盐浓度,如果抗体与目的蛋白的结合力较弱则适当减低盐浓度。

 

 

不同种属和不同亚类抗体与Protein A、Protein G的结合力

 


w:Weak binding,S:Strong binding,w/s:Indifferent,

nb:No binding,—:Information not available

 

 

 

免疫印迹(Western blotting)

 

 (一)原理

 Western blot是一种在 PVDF或硝酸纤维素(NC)膜上进行的抗原抗体反应。蛋白电泳后,将蛋白转移至膜上,再与特异性抗体孵育,洗去游离的抗体,然后和酶标记的二抗孵育,再进行底物显色。由于抗原抗体反应特异性好,亲合力高,Western blot检测的灵敏度较高,尤其是采用酶促增强化学发光的方法(ECL)后,检测的下限可达到pg水平。ECL是指酶催化底物发荧光,荧光可使X光片曝光。由于酶标记在二抗上,二抗与一抗结合,而一抗特异性结合在目的蛋白条带处,因此显影、定影后观察到的条带即为目的蛋白带。

 

(二)试剂和材料

1. PVDF膜或NC膜。

2.电泳缓冲液:25 mM Tris碱、250 mM甘氨酸、0.1%SDS。

3.转移缓冲液:实验所用的PVDF或NC膜不同,转移缓冲液也可能不同,因此请仔细参阅PVDF或NC膜说明书。

4.TBS(pH7.5):6.05 g Tris碱(50mM)、8.76g NaCl(150mM)溶于800 ml双蒸水,用 HCl调 PH至7.5,补加水至1L。

5.TBST:TBS+0.1%(v/v)Tween 20。

6.封闭液:1%试剂盒中的封闭液,或5%脱脂奶粉,溶于TBS中。

7.解离液:100 mM 二巯基乙醇、2%SDS。

8.化学发光Western blot试剂盒:生产这类试剂盒的公司包括 Roche、Pierce、Amersham 等,试剂盒中一般包括酶标记二抗、发光波A和B。

 

(三)操作步骤

1. 灌制SDS-PAGE电泳胶,方法参见一般的分子生物学实验方法。

2. 取免疫沉淀最后所得的上清,上样,电泳。

3. 用电转移装置将蛋白转至PVDF或NC膜上。

4. 电转移完毕后,取出膜,用TBS洗涤1次。

5. 将膜放入封闭液 于室温封闭1 h, 或4℃封闭过夜。

6. 用封闭液稀释识别目的蛋白的抗体至1-10 ug/ml,与含有目的蛋白条带膜在室温作用1 h。

7. TBST洗膜4次,每次15 min。

8. 按试剂盒说明书稀释酶标记二抗,与膜于室温作用30min。

9. TBST洗膜4次,每次15 min。

10. 按试剂盒说明书混合发光液A和B,与膜作用1 min后进行X光片曝光。

11. X光片显影和定影后观察结果。

12. 如果结果不理想或要用相同的膜检测另一种靶蛋白,可将膜与解离液于50℃作用30 min,去除结合于膜上的抗体, TBST洗2次,封闭后可重新检测(即重复 6-11步)。

 

 (四) 注意事项

1.用于 Western blot和免疫沉淀的抗体最好不同,否则将出现很多非特异性条带。

2. Western blot中,转移在膜上的蛋白处于变性状态,其空间结构被改变,因此那些识别空间表位的抗体不能用于Western blot检测。这种情况下,可将表达目的蛋白的细胞或细胞裂解液中的所有蛋白先生物素化,再用抗体进行免疫沉淀,得到的生物素化的目的蛋白可用酶标记亲和素进行Western blot检测。

3.化学发光法检测的敏感度很高,实验中取胶和膜必须带一次性手套。

4. 曝光、显影和定影需在暗室中进行,X光片用完后一定要收好,避免曝光。







(0)

热评文章

发表评论