代谢组学

代谢组学那些事儿(一)

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代谢组学(Metabonomics or Metabolomics) 是继基因组学和蛋白质组学之后发展起来的新兴的组学技术,是系统生物学的重要组成部分,据统计,近些年来代谢组学的研究越来越活跃,美国国家健康研究所(NIH)将代谢组学的发展规划纳入了国家生物技术发展的路线图计划中,许多国家的科研单位也先后开展了代谢组学的研究工作。然鹅,代谢组学毕竟兴起的时间短,老师们对其还不甚了解,小编就收到了许多老师的关于代谢组学方面的疑问,小编在这里将这些问题进行了整理, 希望能对各位老师有所帮助。话不多说, 让我们进入正题吧!

什么情况下选择代谢组学?

首先代谢组学是通过考察生物体系在一特定生理时期内受到刺激或扰动前后所有小分子代谢物的组成及其含量变化,从而表征生物体系的整体代谢特征。其研究对象是分子量1000Da以下的小分子物质,如糖、有机酸、脂质、维生素、氨基酸、芳香烃之类的化合物。如果老师关注的是小分子物质,可以采用代谢组学的方法对样品内检测到的小分子物质进行定性和定量分析。其次,研究代谢物的表达量变化,代谢物与生理病理变化的关系,能够帮助寻找新的生物标记物,发现新的代谢途径,以及更进一步深入了解目前已知的代谢途径,应用于疾病的早期诊断、药物靶点的发现、疾病的机理研究及疾病诊断等方面。

代谢组学我该选择什么平台?

代谢组学的技术平台主要分为NMR、GC-MS、LC-MS。

NRM核磁共振技术,是磁矩不为零的原子核,在外磁场作用下自旋能级发生塞曼分裂,共振吸收某一定频率的射频辐射的物理过程。

优点:

(1)无损的多参数和动态监测技术;

(2)样品需求量小,前处理比较简单,对于复杂的生物样本比较合适;

(3)检测时间短,保证样品在检测时间内维持原有性质;

(4)丰富的分子结构和动力学信息;

(5)同时完成定性定量分析,数据后处理简单灵活;

(6)检测物质没有偏向性。

缺点:

(1)灵敏度低,500HZ的检测限理论为10uM;

(2)检测动态范围有限,很难同时检测一个样品中含量相差很大的物质。

(3)检测的化合物数量有限。

GC-MS全称是气相色谱质谱联用技术,载气推动复杂分析物,经气相色谱分离,进入到高真空质谱系统的离子源进行离子化。根据不同碎片离子在电磁场的不同运动行为,按质荷比(m/z)排列得到质谱信息,进而实现代谢物的定性定量。

优点:

(1)重现性好,技术成熟;

(2)分辨率和灵敏度高;

(3)有成熟的商业数据库,结构定性可靠。

缺点:

(1)样品处理过程繁琐;

(2)检测物质有偏向性,主要分析挥发性物质和可衍生化的具活性氢基团物质。

LC-MS全称液相色谱质谱联用技术。样品在色谱部分和流动相分离,被离子化后,经质谱的质量分析器将子母离子碎片按质量数分开,经检测器得到化合物质谱信息,进而得到代谢物的定性定量结果。

优点:

(1)分析范围广,分离能力强,灵敏度和分辨率高于其他平台;

(2)样本前处理简单,重现性好;

(3)检测物质没有偏向性,可以分析不稳定、不易衍生化、难挥发和分子量大的代谢物,可对极性化合物有较好的检测。

缺点: 

(1)没有成熟的商业数据库, 可鉴定的化合物有限。

GC-MS和LC-MS技术结合了色谱良好的分离能力和质谱的普适性、高灵敏度以及专一性, 是目前做代谢组学常用的技术平台。 但是目前为止没有任何一个检测平台能够同时检测样本中所有的化合物,只能通过选择性的提取结合各检测平台的并行检测来解决。因此在选择平台时应结合自身样本情况与个体需求,综合考虑。

做代谢组学选取什么类型的样本? 样本如何处理?

一般而言,代谢组学样本的类型多种多样,常见的有以下几大类:血清、血浆、尿液、粪便、细胞、细菌、组织、培养液、植物的花、茎、叶等。老师们可根据自己的研究目的选取合适的样本进行实验。

代谢研究的样本处理和采集要遵循“保持最鲜活状态”的原则,采集样本后立即通过置于液氮、干冰或者-80°C冰箱中,阻止样本离体后的进一步代谢活动, 并保证样本在实验前一直处于-80°C以下。

代谢组学的结果包含哪些内容?

结果包含的内容与项目的协议有关。目前我们提供的代谢组学服务有全物质鉴定,非靶向代谢组学和靶向代谢组学服务。

全物质鉴定服务,即检测样本中有哪些代谢物,结果我们只能提供一份定性物质列表的信息。

非靶向代谢组学服务,即普筛或者盲筛,目的在于筛选出两组样本间的差异代谢物,结果我们会提供一份数据矩阵,多元统计分析(PCA、PLS-DA、OPLS-DA),差异代谢物列表,高级分析(差异代谢物层次聚类分析和通路注释、富集分析)。需要注意的是LC-MS非靶向代谢组学分析无法得到全物质鉴定的信息。 GC-MS非靶向代谢组学如果需要全物质鉴定的信息需提前和技术沟通。

靶向代谢组学服务,即已经有关注的物质,检测样本中关注物质的准确含量,结果我们会提供关注的物质在各样本中的准确含量及相应标品建立的标准曲线信息。

开展代谢组学研究,如何设计样本的生物学重复?

代谢物处于生命活动的下游,相较于基因和蛋白,其动态波动性大。因此需要很多生物学重复来增加数据的可靠性和说服力。

对于全物质鉴定的项目:一般情况下是可以不设置生物学重复,也可以设置生物学重复,没有特别的规定,老师可根据实际实验需求进行设置。

非靶向代谢组学项目:是必须要设置生物学重复的。通常情况下细胞/微生物样本每组至少6个生物学重复,模式动物/植物样本每组至少10个生物学重复,临床样本每组至少30个生物学重复。样本重复数量强烈建议大于6个,样本数量过少,后续多元统计分析模型容易过拟合,统计结果不可靠,会遭受质疑。

靶向代谢组学项目:一般是用于验证的,所以生物学重复的个数越多最终的结果是越可靠的。 一般情况下,靶向代谢组学每组至少3个生物学重复,少于3个生物学重复结果是不可靠的。

同一个实验的样品可不可以分成两批检测?

建议最好不要分成两批检测,因为这两个时间点仪器的响应是会发生变化,这样可能导致的问题是一些含量低的物质可能只在一个批次里被检出,这样导致最终的结果不可靠,我们应当尽可能的减少人为因素以及仪器对实验结果的影响。

每组样本的生物学重复个数一定要一致吗?

每组样本的生物学重复的个数不一致也是可以的,但最好相差不要太多,差别不要超过2/3就可以了。相比较而言,每组生物学重复的数量足够多是更为重要的。

代谢组学如何定性的,用的什么数据库?

LC-MS 定性是根据检测到的离子质量数计算加荷模式,比对数据库中的物质的质量数。

GC-MS定性低根据检测到物质定性离子的谱图数据和数据库中物质的谱图进行比对的。

目前代谢组学的数据库是不区分物种的,LC-MS 常用的数据库是Metlin、HMDB以及部分自建库。GC-MS 常用的数据库是Fiehn、NIST以及部分自建库。对于脂质组学项目我们除了使用常用的lipid maps之外, 还用了Q-Exactive 自带的lipid search 数据库,该数据库中有150万种谱峰信息,使定性结果更全面、更准确。

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