代谢组学

代谢组学在急性胰腺炎中的应用及研究进展

急性胰腺炎(acute pancreatitis, AP)是指多种原因导致胰酶激活,继以胰腺自身炎症为主要特征,病情重者可发生全身炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome, SIRS),可伴有器官功能障碍的疾病。根据 AP患者是否有并发症以及是否伴有脏器衰竭 , 将 AP 分为轻症急性胰腺炎 (mild acute pancreatitis, MAP)、中度重症急性胰腺炎 (moderate severe acute pancreatitis, MSAP) 和重症急性胰腺炎 (severe acute pancreatitis, SAP)。 AP 患者的预后存在较大差异, MAP 的预后较好 , 而 SAP 起病急骤, 病死率高,故对其早期准确诊断、快速评估严重程度和合理治疗是学者致力研究的方向。但是目前为止,如何及时识别 SAP的病程进展、严重程度以及重症化机制存在诸多困惑, AP的病因、发病机制、快速诊断、治疗及预防仍然存在众多难点。

代谢组学是在既定条件下,研究小分子代谢产物的相互作用及特征,是系统生物学的重要组成部分。相对于基因、转录和蛋白质研究,代谢组学研究的是细胞活动的最终产物,故也认为是最稳定的。对于 AP,代谢组学是从小分子代谢物的角度研究 AP 的病理生理过程,通过分析代谢物及其转化途径,更好地掌握 AP 的病理过程,以期发现AP 的可能病因、具有诊断价值、预测严重程度及预后的特异性标志物。本文对以下内容进行了综述,以期对 AP 与代谢组学的全面认识有所裨益。

1.代谢组学的概念、优势、研究层次、分类及整合

代谢组学(Metabolomics 或 Metabonomics)是通过研究生物体受到刺激或扰动前后代谢产物图谱的动态变化来研究生物体代谢网络的一种技术,研究对象主要是相对分子质量 1 000 以下的内源性小分子物质 。这些小分子代谢物的概况代表了机体细胞中代谢过程的总结,例如合成代谢、分解代谢、吸收、分布、解毒和能量利用等,能够定性、定量地反映生物体在不同时间及环境下的功能状态。代谢组学其独特优势首先是人体中的代谢终产物数目(约4 000)远低于基因(23 000)或蛋白质(60 000~100 000)。其次,代谢物的变化发生在 DNA、 RNA 和蛋白质改变的下游,更能反映细胞的功能状态。再次,代谢物变化是由内源和外源性因素引起,故生物系统的代谢组学是高度动态的。因此,有人提出,代谢物分析是疾病诊断、分期、检测恶性表型、预测疾病发病和预后,以及开发新药的有前途的工具。基于研究对象及研究目的不同, Fiehn[7] 将代谢组学分为 4 个研究层次 :代谢谱分析、代谢物靶标分析、代谢指纹分析及代谢物组。目前, AP 的代谢组学研究主要在代谢谱分析层次上开展。代谢组学的研究技术手段主要包括核磁共振(NMR)、液相色谱(LC)、气相色谱(GC)、质谱(MS)等。

代谢组学具有高通量和大规模的特点,而样本、技术和处理方法的相对单一需要将其进一步整合以满足代谢组学的需求,因此出现了代谢组学的整合。目前代谢组学的整合主要包括如下 4 类 :(1)整合研究样本。体液、细胞培养液、组织等 ;(2) 整合处理数据方法。对不同的多变量数据统计分析方法进一步整合,尤其是联合了有无监督的多变量数据统计分析方法 ;(3)整合检测技术。 NMR-MS 联合应用, GC-MS 联用技术和核磁共振氢谱(1H- NMR)等 ;(4)整合不同的组学。代谢组学通过整合基因组学及蛋白组学从而更全面、更系统地了解生物体代谢物与蛋白、基因的关系。目前应用最广泛的是 NMR、 GC-MS 联用技术及 LCMS 联用技术。最早、 最为常见的技术之一是 NMR,目前常用的有氢谱(1H-NMR)、碳谱(13C-NMR)和磷谱(31P-NMR),其中以 1H-NMR 应用得最为广泛。

2  代谢组学在 AP 中的应用

AP 的发病机制不明,通常认为是早期胰酶异常激活,导致胰腺自身消化,第二个时期是肠道细菌移位。目前,AP 的诊断主要依靠病史、症状、体征、实验室监测和影像学检查,如超声、 CT 和 MRI[10]。然而,超声是非特异性的,CT 仅用于 72 h 内严重程度的评估或排除其他诊断。由于器官衰竭和细胞坏死, AP 患者的临床表型复杂多样,这些病理损伤会影响患者的代谢,导致早期诊断困难,延误疾病的治疗。代谢组学是对生物逻辑样本进行系统分析的一种方法,它可以提供一个有机体新陈代谢的详细信息。现将有关代谢组学在 AP 和相关疾病的研究及应用分类总结如下。

2.1  代谢组学在 AP 诊断中的应用 

胰腺分为外分泌腺和内分泌腺两部分。内分泌腺分泌胰高血糖素升血糖,胰岛素降低血糖,生长抑素抑制消化腺的分泌,胰多肽抑制胃肠运动、胰液分泌和胆囊收缩。外分泌腺分泌胰液,主要功能是中和胃酸,消化糖、蛋白质和脂肪。因此胰腺的生理作用和病理变化与生命息息相关。胰腺主要通过这些小分子物质与其他器官联系,代谢组学通过对这些小分子物质进行研究,发现 AP 与非胰腺炎的不同之处,以便早期明确诊断。

Villaseñor 等使用 1H-NMR 光谱学和多变量建模学研究了 AP 腹痛患者的尿和血浆的代谢表型,结果表明,由鸟嘌呤、马尿酸和肌酸 ( 尿 )、缬氨酸、丙氨酸和脂蛋白( 血浆 ) 组成的混合代谢标志物在 AP 患者中具有很强的诊断和预后价值。 Tang 等 利用 GC-MS 方法,使用 OPLSDA 模型来研究高血脂的 AP 小鼠和健康小鼠的发病机制,研发了一种代谢组学方法,这项研究已确定了一些独特的代谢物,并提出化学计量学建模的代谢谱可以成为一种检测代谢物的有效工具。 Ma 等提出了一种代谢组学方法,利用高分辨率质子旋转 NMR 研究 Wistar 大鼠急性坏死性胰腺炎和慢性胰腺炎(CP)的代谢物,提出在胰腺发生损伤之前,炎症就会导致代谢产物亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸和牛磺酸等水平发生改变。代谢物水平的测定有助于深入了解机体病理生理状况,从而有助于疾病的早期诊断。

Xiao 等 采用 GC-MS 法通过分析发现 3- 羟基丁酸、磷酸、甘油、柠檬酸、 D- 半乳糖、 D- 甘露糖、 D- 葡萄糖、十六烷酸和血清素在 AP 早期患者和正常人的鉴别中差异有统计学意义,为 AP 早期诊断提供可能。

2.2  代谢组学对明确 AP 病因的应用价值

AP 病因多种多样,胆源性、脂源性、酒精性是 AP 的主要病因,不同年龄段发生 AP 的病因不同, SAP 中酒精性 AP 所占比例最高。苗长奎通过对 2014 年 12 月至2016 年 11 月在吉林省永吉县医院治疗的 60 例 AP 患者临床研究发现,胆管疾患是主要病因。张娜等用 Meta 分析法研究了我国近 10 年 AP 病因构成的演变特点,结果发现胆源性疾病仍是 AP 的最常见病因,其中以胆道结石为主,因此减少胆源性 AP 的发生可从防治胆结石的入手。日本神户大学医学院 为了评估 AP 引起的低相对分子质量代谢物水平的变化,应用 GC-MS 技术监测了使用蛙皮素和精氨酸诱导的 AP 小鼠血清和胰腺组织中代谢物水平的变化。研究显示在蛙皮素处理的小鼠中,组织中丙酮酸 + 草酰乙酸水平显著低于对照组,在精氨酸处理小鼠的胰腺组织中,琥珀酸的水平低于对照组,但两者柠檬酸 + 异柠檬酸水平较高,研究结果表明丙酮酸 + 草酰乙酸及琥珀酸有可能作为鉴别 AP 病因的代谢标志物。

2.3  代谢组学对 AP 病变严重程度的识别 

SAP 占 AP 的 15%~20%,常引发胰腺组织感染、全身炎症反应综合征以及多器官功能障碍综合征等,严重威胁患者的生命,病死率较高,所以病变严重程度监测对于 AP 诊断、分期、预后及治疗有重要意义。 SAP 的特点是持续器官功能衰竭 48 h,所以应尽早治疗。出现持续器官功能衰竭及胰腺感染性坏死的患者死亡的风险高达30%~32% ,因此从代谢组学的角度研究 AP 严重程度对临床工作很有必要性和指导意义。

Xiao 等 以 GC-MS 为基础成功建立了血清代谢组学方法,来确定 AP 患者的代谢物变化,并选择一些重要的代谢物作为 AP 的潜在代谢标志物。在 SAP 和 MAP 之间筛选的代谢标志物中,发现 3- 羟基丁酸和柠檬酸是潜在的代谢标志物,这一结果与 AP 患者和健康对照者分析结果相一致。这表明,这两种代谢物可以作为区分 SAP 和 MAP患者的潜在代谢标志物。 Xu 等经过对 AP 患者代谢物研究发现, AP 患者血清中鞘氨醇、辛酰胆碱、十四烷酸、癸酰基胆碱、十二烷醇、 2- 十四酮含量显著升高。鞘氨醇是机体细胞膜的组成成分之一, AP 时血清鞘氨醇水平升高可能是胰蛋白酶水解造成机体大量细胞破裂所致。在细胞和血清实验中,鞘氨醇浓度与炎症的严重程度呈正相关 ,辛酰胆碱和癸酰基胆碱都属于胆碱类物质,都是脂肪酸与胆碱在胆碱乙酰转移酶作用下通过酯化反应形成的产物。胆碱类物质代谢通路是炎症反应中的重要通路之一,在小鼠 AP 模型中,胆碱酯酶与 AP 的严重程度呈正相关,而胆碱乙酰转移酶与 AP 的严重程度呈负相关,故它们在不同严重程度的 AP 患者血清中含量不同。

2.4  代谢组学在 AP 鉴别诊断中的应用

现今阶段, AP 的临床诊断准确率虽然有很大升高,但仍易与许多疾病混淆,例如胆道系统疾病、胃及十二指肠溃疡穿孔等。特别是胆石症、胆囊炎,在临床诊断中通常是依据患者血清淀粉酶与脂肪酶上升的倍数来区分,但是这种方法的特异性不高,在无影像学支持的情况下易出现误诊。因此,提高对 AP 的诊断很有必要。 Xu 等应用超高效液相色谱与高分辨质谱联用 (UPLC-HRMS) 分析平台对 38 例 MAP 患者、 26 例胆石症患者及 36 例健康志愿者的血清进行分析研究,筛选差异代谢物,结果可靠的有鞘氨醇、辛酰胆碱、甘氨胆酸、十四烷酸、癸酰基胆碱、十二烷醇、 2- 十四酮、 L- 甲状腺原氨酸 8 个代谢物。分析结果显示与胆石症患者比较, AP 患者血清鞘氨醇、辛酰胆碱、十四烷酸、癸酰基胆碱、十二烷醇、 2- 十四酮含量显著升高,而甘氨胆酸、 L- 甲状腺原氨酸含量显著下降。这表明,这 8 种物质可能可以作为鉴别 AP 与胆石症的代谢标志物。

2.5  代谢组学可鉴别 AP 与 CP

胰腺炎有两种形式,即 AP 和 CP。 AP 突然发病,并在几天内消退或恶化。相比之下, CP 病程的演变持续数年。 CP 的确切发病机制不明确,且常被误诊或漏诊,但每年的发病率仍有约 30/100 000。没有具体的治疗方案可用于阻止 AP 的急性炎症反应或延缓 CP 的进展。胰腺中代谢反应的表征是鉴别 AP 和 CP 潜在的有用指标。 Lusczek等 应用 1H-NMR 代谢组学,将 AP 和 CP 患者的尿代谢特征与健康对照组进行比较,再进行 Bonferroni 校正的成Wilcoxon 秩和检验发现健康对照组中的柠檬酸盐浓度高于CP 患者。相反,健康对照组的尿腺苷浓度低于 CP 患者。总之尿样代谢物可以将健康对照组与 CP 或 AP 患者区分开。Vinokurova 等报道, CP 患者血清甘氨胆酸呈下降趋势。

2.6  代谢组学指导 AP 的治疗及预后 

2.6.1 代谢组学在 AP 治疗及预后中的价值 AP 治疗方法主要是传统的消化酶抑制剂应用、营养支持及对症支持治疗。虽然传统治疗方法很多,但是 AP 的病死率依然很高,因此,有必要寻找新药新方法治疗 AP 和改善患者全身症状。代谢组学技术是动态监测机体受到扰动或在疾病状态下代谢产物的改变 , 这正满足目前个性化医疗和精准医学的要求。日本神户大学医学院  应用 GC/MS 技术监测了使用蛙皮素和精氨酸诱导的 AP 小鼠血清和胰腺组织中代谢物水平的变化。结果表明在 AP 小鼠中,参与三羧酸循环周期初始阶段的代谢物水平升高,而参与三羧酸循环周期后期的代谢物水平降低。 AP 患者往往表现出高动力和高代谢状态,这些对 AP 患者中后期高能量、高蛋白治疗提供了依据。研究结果还表明补充谷氨酸和 O- 磷酸乙醇胺减轻了蛙皮素诱导的 AP 的严重程度。有研究对部分 AP 患者血清差异代谢物含量与对照组进行动态检测,发现鞘氨酸、 L-甲状腺原氨酸、甘氨胆酸及 2- 十四酮 4 种代谢物随着治疗呈下降趋势,并接近正常水平,所以这 4 种物质可能作可以为 AP 临床病程监测的代谢标志物,给予适当干预。

2.6.2 代谢组学在中药方剂治疗 

AP 的整体疗效及机制中的作用 代谢组学研究是中医药现代化发展的一个好的切入口 , 具有检测及时、全面、无损、动态等特点,是一种整体分析技术,这与中医的整体观高度吻合。几十年来中药大承气汤(方)已被广泛用于治疗 AP。既往的研究已经证实它有较好的增强胃肠动力、防止肠道菌群移位、抗内毒素和改善胰腺微循环等作用。然而,目前研究大多只是集中在单一的靶点或通路上,代谢组学为大承气汤的整体效果研究开辟了新路径。 Li 等用 1H-NMR 的代谢组学分析方法,应用 AP 模型做实验,以研究大承气汤治疗 AP的机制。结果显示大承气汤组大鼠的血浆中甘油、谷氨酸、低密度脂蛋白(LDL)、饱和脂肪酸(FA)浓度较高,而丙氨酸和谷氨酰胺浓度较低,即大承气汤能改变 AP 的代谢物的浓度,同时也证明 1H-NMR 的代谢组学方法是系统地阐明大承气汤治疗 AP 的整体效果和作用机制的可靠方法。

3  结语

代谢组学在 AP 的病因、发病机制、诊断及鉴别诊断、治疗和预防中的应用具有很大优势,但是目前 AP 代谢组学的研究仍处于早期阶段,代谢组学在 AP 中的相关研究较少,真正应用于临床尚需进一步系统、全面的研究验证。而且由于检测技术及样本的差异,对相关代谢产物或代谢途径尚不能进行全面的定性及定量分析。但是有理由相信随着整合代谢组学的发展及其在 AP 中的不断研究深入,利用代谢组学阐明 AP 发病机制并进行有效诊断、指导治疗和预防的良好前景。







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