代谢组学

如何开展代谢组学实验(上篇)

近期小编将为大家讲解代谢组学相关知识,包括代谢组学简介,代谢组学分类和应用,代谢组学的实验流程及数据分析,代谢组学的技术手段,代谢组学实验如何来设计,代谢组学样本采集指南,高分代谢组文章解析等,每天只需5分钟,轻松学习代谢组学相关知识~

话不多说,进入今天的专题:如何开展代谢组学实验,先来看看本期专题的前两个章节——代谢组生物样本制备及代谢组研究的技术手段。

 

代谢组处于基因调控网络和蛋白质作用网络的下游,提供的是生物学的终端信息。那么作为提供终端信息的代谢组学,它的实验流程是怎样的。

代谢组学的实验流程,主要包括生物样本制备、代谢物分离、检测与鉴定、数据分析与生物学阐释(见图1)。


  

图1 代谢组学的实验流程

 

 

1.生物样本制备

 

代谢物主要通过各种体液排出体外,因此各种易于获得的生物体液(包括尿液、血液、唾液以及粪便提取物等)是代谢组学研究的主要样本。同时,各种复杂的生物组织和细胞样本,如临床上或动植物实验中取得的病理组织或动植物组织,也是代谢组学研究的样本。

由于机体各个组织器官均参与着代谢过程,每个细胞都有其代谢产物的释放,而周围环境可改变细胞的功能,因此,代谢谱容易受到众多因素的影响,收集代谢组学研究的样本需要进行严格的控制。收集样本时需要考虑收集的时间、样本的保存条件和保存时间等的平行性。特别是临床生物样本不易控制,要考虑受试患者和健康对照人群之间的年龄、性别、饮食状况、作息习惯、体重、用药情况等因素的匹配。这些因素的改变均可导致代谢谱的变化,影响实验结果。

相较于基因和蛋白,代谢物处于生命活动的下游,动态波动性大。因此需要更多生物学重复来增加数据的可靠性和说服力。

1.植物样本:最少 6 次,建议 8 次生物学重复;

2.模式动物及微生物样本:最少 8 次,建议 10 次生物学重复;

3.临床样本:至少 30 次生物学重复以上, 建议 50 次以上。

注意,样本不能 pooling,不能反复冻融。

PS:不同类型样本的具体采集方法,将在接来的《代谢组学样本采集指南》专题中为大家呈现。

 

2.代谢组研究的技术手段

 

根据样本性质、实验目的和各代谢物理化性质的不同而选择不同的分析鉴定技术。目前最常用的分析鉴定技术主要有色谱质谱联用和核磁共振(NMR)。

色谱质谱联用技术:利用色谱的分离作用和质谱的鉴定作用能够对代谢物进行快速的定性分析和准确的定量(见图2)。同时由于质谱具有极高灵敏度的特性,使得更多低含量的代谢物可以被检测到。


  

图2 基于色谱质谱联用鉴定代谢物

色谱质谱联用包括液相色谱-质谱联用(LC/MS)和气相色谱-质谱联用(GC/MS)。

 

液相色谱-质谱联用(LC/MS)

液相色谱-质谱联用,Liquid
Chromatography-Mass Spectroscopy(LC/MS),是一种分辨率相对较高的分离分析技术,具有灵敏度较高,动态范围较宽,无需衍生化等优点,因而成为代谢组学研究常用的技术。LC/MS主要分析范围有不挥发性化合物分析测定;极性化合物的分析测定;热不稳定化合物的分析测定;1000 Da以内的大分子量化合物包括蛋白、多肽、多聚物等的分析测定。

 

气相色谱-质谱联用(GC/MS)

气相色谱-质谱联用,Gas Chromatography-Mass
Spectroscopy(GC/MS),是主要针对挥发性物质进行分离鉴定的质谱技术,配套有相对完善的美国国家标准技术学院(NIST)数据库,在代谢物鉴定方面具有一定优势,是植物代谢组学研究方面常用的分析技术。

在动物代谢组学方面,因动物的内源性代谢产物以不挥发性物质居多,分析样本需要经过复杂的化学衍生化处理才能实现分析,限制了GC/MS的应用。但随着衍生化试剂和方法的创新,GC/MS开始逐渐运用于动物代谢组学。与LC/MS相比,GC/MS所检测的化合物主要集中在极性程度低,分子量相对小的代谢物( 300 Da)(见图3)。


  

图3 LC/MS和GC/MS鉴定代谢物的异同

核磁共振(NMR)

核磁共振,Nuclear Magnetic Resonance(NMR),能够实现对样本中代谢物没有偏向性,对所有化合物的灵敏度都是一样的;具有样本无损伤性,不会破坏生物样本的结构和性质;不需要复杂的前处理,生物样本可以在接近生理条件下进行实验;并可以进行实时和动态检测。

但是NMR缺点也很明显,主要表现在:灵敏度较质谱低几个数量级,难以检测到丰度较低的代谢物;对于能检测到的但低含量的代谢物信号较弱;同一个代谢物会有多个信号,有的信号为不同代谢物的信息叠加的结果;核磁所能给出的为结构片段信息,将这些片段进行代谢物的归属往往比较困难。

 

3.小结

 

不同的代谢组鉴定技术具有不同的特点(见图4)。GC/MS擅长对挥发性、极性低的代谢物进行分析鉴定,对不挥发性代谢物无能为力。而LC/MS擅长对不挥发性化合物、极性化合物、热不稳定化合物、以及1000 Da以内的大分子量化合物进行分析鉴定。NMR检测代谢物具有没有偏向性,无损伤性,前处理简单以及具有实时和动态检测的特点,然而它的检测灵敏度较低。因此,更全面的代谢组分析鉴定,应根据研究对象特征和目的,灵活地将一种或多种代谢组鉴定技术有机组合,发挥各自的优势。

  

图4 LC-MS、GC-MS、NMR鉴定代谢物的灵敏度和数量级

今天的内容分享完啦,大家记得收藏好慢慢学习哦~

联川生物







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