代谢组学

代谢组学实验中应该如何做选择?

在代谢组学实验中,我们会遇到很多需要我们做出选择的情况,比如样本检测时选择GC-MS还是LC-MS、LC-MS检测时是选择full scan还是DDA或DIA?这些选择有一些需要根据自己的实验情况进行选择,有一些则没有一定之规,只要做到有据可循即可。那这篇文章就简单的总结一下在代谢组学实验中需要我们做出选择的情况。因为我的专业侧重质谱分析,所以侧重点可能会偏向样本检测方面。

质谱仪如何选择?

“我们这里有xxx质谱仪,请问能否开展代谢组学实验?”之前收到过类似的问题,这类问题主要还是关于质谱仪的选择。对于LC-MS而言,要开展非靶向代谢组学,必须要有高分辨质谱仪如TOF、Orbitrap等等,因为非靶向代谢组学是以发现为目的的,所以需要尽可能多的检测到存在于生物样本中的化合物,分辨率越高的质谱才能保证检测到的化合物越多。当然也要在分辨率和扫描之间做好平衡,现在都高分辨质谱仪都提供了多种分辨率可供选择,同时也会给出不同应用场景下的推荐值。

在样本检测时,选择GC-MS还是LC-MS?

首先要知道两者有什么不同,两种技术最大的区别在于所监测到的化合物的类型(分子量、极性等)不一样。由于仪器的特性使得GC-MS检测的质量范围通常在600以下,而LC-MS检测的质量范围可以很高,通常我们选择1000或者1500以下。所以如果实验中要检测的化合物为脂肪酸、氨基酸等物质,可以选择使用GC-MS,当然也要配合适当的样本前处理;如果除了检测分子量较低的物质之外,还需要检测胆碱、磷脂类等物质,则需要使用LC-MS。

GC-MS检测相对容易标准化,另外化合物的鉴定相对容易,加上标准品数据的长期积累使得鉴定的结果更加可靠,这也可能是一些公司在非靶向代谢组学实验中只提供GC-MS检测的原因。

在获取原始数据时,选择full scan还是DDA或者DIA?

首先要搞清楚这几种扫描模式的区别,full scan用来获取化合物的一级质谱信息,DDA或者DIA是用来获取化合物的碎片信息,这几种扫描模式可以独立使用,也可以组合使用,了解到这一点之后就可以根据实验的需要来选择合适的采集模式。

非靶向代谢组学中,必须要包含full scan的数据,因为在进行峰的提取和对齐时,需要使用full scan的信息。DDA或者DIA与full scan组合使用(如Q-TOF的MSe模式和赛默飞Q-Exactive的full mass-ddms2模式),可以使我们一次进样同时获取一级质谱和串联质谱信息,方便之后进行数据库检索。当然这两种获取碎片离子的方式又各有其优缺点,很多研究者也针对他们各自的特点开发了不同的方法,所以绝对完美的方法还不存在,根据自己的仪器和实验要求选择适合自己实验的采集模式。

标记物筛选时,VIP值要大于1还是2?Fold change阈值选择1还是2?

个人认为,代谢组学作为系统生物学的重要组成部分,每一个实验都都可以获得海量的数据,从庞大的数据中筛选出真正有价值的数据,本身就不是一件百分之百有保证的操作。假如我们在筛选标记物时规定Fold change大于2.0,那么1.999怎么取舍?另外,受限于样本本身的性质以及分析平台(质谱,核磁等)的限制,实验最后能得到的数据中,并不是每一个都能反应样本真实的差异(当然我们要尽最大的努力去排除不必要的干扰)。所以,在筛选标记物时,没有必要纠结是不是应该有一个标准的数值(文章中报道的数值也并不统一),多数情况下,我们需要选出的是在统计学上有意义,在生物学上可以自圆其说的标记物。

但是!实验如果只是停留在标记物的阶段,恐怕已经不能满足我们的需求,所以需要对所选择的标记物进行进一步的验证。如果要对实验进行深入的研究,则需要我们结合研究本身(如所研究的疾病的发生发展、所评价药物的作用等)对数据进一步的挖掘,对已选择的标记物进行更深层次的筛选,最后选择出“真正”的标记物进行生物化学或分子生物学实验的验证,阐明与之相关的生理病理过程。







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