代谢组学

检验医学与代谢组学

       作者:黄山

         单位:贵州省临床检验中心

第一节 代谢组学概述

一、代谢组学基本概念

       代谢组学是继基因组学、转录组学和蛋白质组学之后必起的系统生物学的一个新的平台,其定义为:定性、定量考察生物体系受到刺激或扰动后其代谢产物的动态变化,揭示机体生命代谢活动本质的科学。代谢产物作为生物体各种病理生理过程的最终产物,其整体表现能够为深入了解机体生理现象及病理机制提供丰富而实用的信息。
       代谢组学力求对生物样本中尽可能多甚至化合物进行检测,反映生物体内部的代谢状况。检测的化合物为分子量较小的代谢底物或代谢终产物。它除了对生物标志物进行确认和功能分析,还需研究其参与的代谢反应、所处的代谢通路。
       代谢组学的特点可归纳为:系统性、整体性和动态性。完整的代谢组学研究步骤包括样品的制备、数据的采集和分析及潜在生物标志物的发现。

       大量实验证明,单一的研究样本、检测技术以及数据处理方法,已无法满足代谢组学高通量、大规模的需求,“整合”技术便应运而生,形成了“整合化”代谢组学。已经实现的“整合”包括:①研究样本的整合,如体液、组织及细胞等的整合。②检测技术的整合,核磁共振与质谱及其联用技术是代谢组学研究中常用的分析技术,各有优劣,为了扬长避短,带有平行磁共振的液相色谱质谱技术的出现,构成了质谱与核磁共振在住线组合系统,它具备了3种检测技术的优势,能够提供综合的结构化数据,同改进后的新技术,如流动探头、液相色谱、在线固相提取物和磁共振一起被广泛用于从复杂生物样本中鉴定新的潜在的药物。③数据分析技术的整合。只有对原始数据进行深层次的挖掘,才能更全面地获取有生物学意义的标志物。常用的数据处理方法有主成分分析、偏最小二乘法等。目前,通过大量的研究,数据的整合可以通过多种途径再不同水平上实现,并需要运用特殊的统计方法和多种模式识别方法。④组学间的整合。为了更好的发挥其系统性,可以通过与蛋白组学、转录组学及基因组学的整合,从不同角度更全面更系统地理解代谢物与蛋白表达基困变异之间的联系,最终实现代谢组学的目标。代谢组学的发展促进整合化的发展,而整合化的发展同时促进了代谢组学的进步。目前,代谢组学已广泛应用十多种领域。

二、代谢组学技术

       与以往各种组学技术相比,代谢组学技术有其特有的优势。首先,其通过高通量的检测手段能够同步平行测定各类代,谢产物的含量及结构信息。其次,上游基因和蛋白层面的变化能在下游诸多代谢产物中得到放大,从而使得这些变化更容易被观察到。再者,代谢产物的整体变化可以直接反应机体的状态。因此,这一技术能够为临床疾病的早期诊断、疾病分型、预后分析及个体用药反应等研究提供帮助与支持。

       目前,代谢组学被认为是系统生物学的分支学科之一,能够通过全面的定性定量分析,就代谢物在机体处于正常生命状态及内外环境变化后的动态反应进行研究。代谢组学的研究对象为体内所有小分子代谢物,包括代谢中间体及终产物,分子量多在1 kD以下。样品可以是血清、血浆、器官组织及细胞标本,也可以是唾液、汗液等特殊标本。代谢组学的检测技术涉及色谱、质谱、电泳以及核磁共振等等。归纳起来,常用检测平台主要包括两大类:即基于色谱质谱联用的检测技术(Chromatography-Mass)以及基于核磁共振的检测技术(nuclearmagnetic resonance,NMR)。前者具有较高的灵敏度和分辨率;后者则具有重复性好且能对样本进行无创性检测等优点。同时,随着代谢组学研究队伍的逐年扩大,检测技术的水平也在飞速提高。串联色谱、多维质谱及超大功率磁共振平台等概念正驱使代谢组学相关实验技术朝着通量更高、定性更易、定量更准的目标发展。

      应用各类化学计量学的数理方法处理原始数据并高效准确地转换为代谢物信息是代谢组学研究的一个重要组成部分。其过程包括针对原始谱图信号中出现的基线漂移、噪声干扰等问题进行的数据预处理,还包括结合研究目的对海量代谢物信息进行数据挖掘以及在定性过程中的数据库检索匹配等等。同时,为了能够科学高效的安排实验、优化实验参数。近些年来,许多实验设计(DOE)方法正被逐步引入代谢组学的研究当中。代谢组学研究一般包括四个部分:样品制备、代谢产物分离、检测与鉴定、数据分析与模型建立。

        1.核磁共振(NMR)技术

       NMR在代谢组学研究中应用较多,能够对样品实行非破坏性、无偏向性分析,包括ID sequences、CPMG、diffusion-edited secluence、2D J-RES等方法。NMR方法中存在灵敏度低、分辨率不高、有可能形成信号重叠、低丰度的代谢产物容易被高丰度的代谢产物所影响的普遍缺点。除了NMK技术外,常用的还有质谱分析技术。由于NMR方法本身对标本无破坏,因此标本采用NMR方法检测后还可以用于质谱检测,目前也有研究者将两者结合起来用于代谢组学分析研究。

         2.质谱技术

        质谱也是目前应用广泛的代谢组学分析方法之一。质谱方法又可以分为液相色谱-质谱联用技术(LC-MS)、气相色谱-质谱联用技术(GC-MS)以及高效液相色谱-质谱联用技术(HPLC-MS)等。

     (1)LC-MS法:采用液相色潜和质谱联用技术来分离代谢产物,由于其样品准备过程较为简单,因此普遍用于高通量检测。此方法尤其适用于体液代谢组学分析,如尿液、血清等样品。但缺点是会有离子抑制现象影响结果。

     (2)GC-MS:与LC-MS相似,采用气相色谱和质谱联用技术来分离代谢产物,由于方法较LC-MS更为灵敏、重复性更好,因此比LC-MS方法分离效率高。但是样品准备过程时间比较长,并且部分代谢产物用此方法不能分离。另外样品衍生物会增加数据分析的复杂性。

      (3)超高效液相色谱分析法(UPLC):在LC的基础上加以改进,在高噪声背景下提高了对于信号的检测效率。

       3.毛细管电泳-质谱联用技术

      毛细管电泳对于极性代谢产物具有很好的分离效果,分辨率较高,耗费的溶剂少,成本较低。它与质谱联用在代谢组学研究中得到了广泛应用,例如对于核苷酸合成、修饰等的分析。但是毛细管电泳也有固有的缺点,例如稳定性较差,且由于毛细管电泳分离缓冲液需要适合质谱检测的要求,因此不是所有的毛细管电泳分离模式都能与质谱联用。

      目前代谢组学技术仍然存在一定的局限性,包括代谢产物在分子量、极性、丰度、易挥发性等属性上的悬殊差异导致尚无一种测试平台的检测窗口能够完全覆盖所有代谢产物;并且,对于代谢组学研究中海量原始数据的处理仍待提高改良,以便更有效率的剔除噪音并获得更多物质信息;再有,如何全面解释分析代谢组学获得的生物学信息也需要其他平台技术的支持与补充。所以,与其他组学一样,代谢组学技术平台的单独运用不一定进行得全面。同一组学内、不同组学之间各类技术平台的交叉互补可能有助于这一问题的改善。在肾脏疾病中,有关前列腺癌代谢组学研究发现尿中差异代谢物中肌氨酸的水平与肿瘤生长及转移存在相关。还通过RNA干扰借导阻抑实验,在离体肿瘤细胞中通过下调肌氨酸合成相关甘氨酸N甲基转移酶及降解相关肌氨酸脱氢酶,明确了肌氨酸对于肿瘤细胞侵袭能力的调节作用。该研究基于代谢组学的发现并整合其他平台技术,对系统性阐述肌氨酸在前列腺肿瘤中的临床价值及生物学意义做出了巨大贡献。同时,该研究也向我们展示了代谢组学在融合其他系统生物学技术后的魅力所在。

       综上所述,相比基因组学、蛋白组学,代谢组学仍处于较为幼稚的阶段。其研究成果与临床医学的衔接也有待拓展与进步。基于代谢物研究获得的生物学信息,诸如疾病相关差异代谢轮廓以及生物学标志物的发现,也有待于后续各类研究的开展加以验证完善。

第二节 代谢组学在临床中的应用

一、肝病

       肝脏是人体重要的代谢器官,参与了多种物质的体内代谢。肝脏病变必然引起代谢产物组分发生改变,对这些代谢组分进行分析将有助于对病情作出合理判断,并可能作为将来指导临床用药的重要参考指标。

       由不同药物引起的肝损伤中,代谢组学研究存在明显差异。在四氯化碳诱导的肝损伤小鼠模型尿液中,发现有23种代谢组分与四氯化碳引起的肝损伤密切相关。在四氯化碳和α-萘基异硫氰酸盐造成的大鼠肝损伤模型中,部分胆汁酸改变明显。研究者发现,在甲酸烯丙酯引起的肝毒性小鼠模型中,血肌酸和酪氨酸升高,尿牛磺酸和肌酸升高,尿三羧酸循环中间体减少。在溴苯引起的大鼠肝损伤模型中,5-羟脯氨酸尿存在明显异常。

       研究者采用HPLC/MS技术对肝炎、肝硬化和肝癌的代谢组学进行分析鉴别,发现有8种代谢组分在3种疾病中存在较大差异。该代谢组学分析对肝癌诊断的准确率为83%,肝硬化诊断的准确率为88.9%,可以较好的鉴别诊断肝癌与肝炎、肝硬化。另外,有研究基于NMR的代谢组学分析发现在肝癌组织和癌旁组织的代谢谱存在差异,同时癌症恶性程度低和高的患者癌组织代谢谱也存在着差异。这些有差异的代谢物质主要包括乳酸、磷酸乙醇胺、胆碱磷酸、氨基酸、葡萄糖以及糖原。

二、肿瘤

        1.乳腺癌

       目前已经有大量代谢组学研究集中在对乳腺癌新标志物的筛选上。研究发现,乳酸盐、脂质、胆碱磷酸、胆碱以及甘氨酸与乳腺癌存在着密切的关系,且乳腺癌上皮细胞中脂肪酸合成增加基于NMR数据的多元统计分析可以区分乳腺癌和癌旁组织,特异性为100%,敏感度为82%。也有研究通过呼出气体的差异对乳腺癌进行诊断,研究发现通过呼出的挥发性气体的差异可以使得癌症患者的检出率特异性为94.1%,敏感性为73.8%。

        2.卵巢癌

       研究者采用1H NMR方法对卵巢癌和非卵巢癌(包括良性卵巢囊肿和正常对照)进行检测,发现某些代谢物质对于两者的区分度可以达到97%~100%。但是这些存在明显差异的物质包含两个来自脂质代谢以及3-羟基丁酸代谢的非特异性代谢物质,这两组物质的代谢产物也在其他代谢组学的研究中以及肠道微生物群代谢物中发现。另外采用GC-MS方法研究发现51种代谢产物在卵巢癌和癌旁组织中存在明显差异,对于区别两者的准确率可达88%。

        3.肺癌

       近年来,对于肺癌代谢组学的研究主要基于GC-MS的方法对呼吸道气体标本进行代谢组学分析。虽然目前已经有许多气体代谢组分被证明在肺癌患者和正常人中存在明显差异,但是诊断的准确度尚未达到90%。研究者也尝试从其他体液标本,如血液、尿液中寻找新的生物标志物。基于GC-MS的研究发现,肺癌患者血清中两种醛类物质—己醛和庚醛,含量明显高于正常人。研究者建立了小鼠肺癌模型,对其尿液代谢组学进行研究,发现肺癌小鼠尿液与正常小鼠尿液相比存在着大量不同的代谢产物,这些代谢产物主要来自嘌呤代谢通路。

        除此之外,代谢组学还广泛用于其他肿瘤,包括前列腺癌、子宫颈癌、肾癌等新的肿瘤标志物的筛选,目前这些在癌症患者和正常人中存在的差异代谢物质是否可以成为新的肿瘤标志物尚待进一步的研究证明。

三、糖尿病

     对于非胰岛素依赖的2型糖尿病(DM2),目前有两种方法用于其代谢组学分析。一种是针对特定代谢产物的靶标分析;另一种是不针对特定代谢产物的非靶标分析。

       针对DM2特定代谢产物的标靶分析,主要集中在酯化脂肪酸(EFAs)和非酯化脂肪酸(NEFAs)的研究上。研究发现DM2患者血浆中EFAs和NEFAs结构与正常人没有差别,但是浓度上有明显差异。总NEFAs浓度在DM2患者血浆中增加,其中16∶0、18∶1n-9和18∶2n-6在DM2患者和正常人中差别最为显著。另外糖尿病患者血浆中的一些磷脂分子也和正常人存在明显差异,这些磷脂包括脑磷脂(PE)16∶0/22∶6和PE 18∶0/20∶4以及溶血磷脂胆碱(LPC)16∶0和LPC 18∶0,这些分子可能是糖尿病的潜在生物标志物。

       另一方面采用非靶标代谢组学方法对DM2也展开了研究。糖尿病患者除了与能量代谢相关的包括脂肪氧化以及糖异生的代谢谱发生变化以外,核苷酸代谢谱也发生了明显变化。研究发现N-甲基烟酰胺和N-甲基-2羟基吡啶-5羟胺在糖尿病患者中增加明显,为DM2病程发展的监测提供了潜在的生物学新指标。另外,NMR分析发现,虽然葡萄糖和丙酮酸盐在糖尿病患者血浆中明显增加,但是肌酸酐和醋酸盐与正常人相比明显减少。非靶标代谢组学方法也应用到了糖尿病并发症的研究中,包括糖尿病肾病、糖尿病视网膜病变以及糖尿病引起的心血管疾病等。

       除了以上疾病之外,代谢组学还广泛应用于多种疾病的研究中,包括多种心血管系统疾病、神经系统疾病等。随着代谢组学进一步的研究,这些新的潜在的生物标志物将可能应用到临床实验室检测中,为实验室诊断提供更为快速简单的指标,并及时监测病程进展以利于临床治疗。

四、肾脏疾病

       肾脏疾病与全身代谢异常密切相关。基于代谢组学技术的特点与优势,该技术在肾脏病领域中的应用正逐步体现出越来越大的临床价值。

        1.肾毒性损伤

       肾脏易受到各种毒物(包括临床药物)的损害,然而肾毒性损伤早期常难以发现且目前的诊断技术还很局限,而代谢组学在该领域的研究起步较早。上世纪90年代,就已经通过质子核磁共振技术(1H-NMR)对单独暴露于3类共15种肾毒性物质下的大鼠尿液代谢物变化进行了分析。发现不同毒性物质作用于大鼠后其尿液氢谱轮廓各具特性,局部尿代谢轮廓的变化对肾脏损伤的部位具有指向性。且尿液中代谢物浓度变化与毒物作用时间存在相关性。

       2008年9月,基于三聚氰胺事件,该物质肾毒性损伤的相关研究一时成为热点。通过大鼠摄入不同剂量三聚氰胺对比三聚氰酸摄入及两者混合摄入,发现特征性的代谢扰动与三聚氰胺摄入剂量存在相关。而混合摄入两种毒物对色氨酸、聚胺及酪氨酸代谢存在干扰,并对机体三羧酸循环及肠道微生物结构造成扰动。随着中医药在国际上逐步得到认可和推广,草药相关的肾毒性研究也正日益得到国际认可。牵牛子、广防己等传统药物,以及诸如马兜铃酸等草药成分的肾毒性研究也日益多见。同时,作为代谢组学直接衔接临床应用的重要领域,临床治疗药物所致的肾毒性研究也提示该组学平台,尤其是代谢轮廓分析技术能够为毒性损伤的早期检测及病理机制阐述提供极大帮助。

        2. 急性肾损伤(AKI)

       AKI的早期诊断有助于临床及时干预并改善患者的预后。代谢组学技术由于其高通量的检测能力以及高效的数据处理分析能力,为AKI的诊治和研究提供了新思路。有学者在大鼠肾脏单纯缺血及缺血再灌注损伤模型中,运用1H-NMR进行检测,分别鉴定出肾组织中30余种及血液中50余种代谢产物。其中尿囊素(Allantoin)、多不饱和脂肪酸、三甲胺氧化物(TMAO)等与肾缺血时间和疾病严重程度存在良好的相关性,从中不仅证实了氧化应激及肾髓质损伤在肾脏缺血再灌注损伤中起重要作用,还展示了由这些代谢物构成的代谢轮廓改变能够较血肌酐更好的评估损伤严重程度。

       3. 糖尿病肾病(DN)

      DN作为一种常见的继发性肾损害,也获得了代谢组学的青睐。有学者应用基于色谱质谱联用的检测技术,建立了2型糖尿病、糖尿病肾病患者以及正常人的血清代谢轮廓,根据代谢物信息构建的PCA模型能够将三者清晰地区分开来。同时,筛选得到的亮氨酸、二氢神经鞘氨醇以及植物鞘氨醇等代谢产物含量的变化还提示了糖尿病患者可能存在特定的氨基酸代谢及磷酸代谢等异常。有研究还发现在正常人、单纯糖尿病患者与各期DN患者(III期~IV期)之间,肌酐、尿酸、黄嘌呤、次黄苷及腺苷酸等5种物质浓度变化差异有统计学意义。提出该5种物质可能可以作为DN发生发展的代谢标志物,值得进一步考证。这些研究不仅展现了代谢组学技术在同步平行检测大量疾病相关代谢产物上的优势,更通过实验方法学上的论证证实了其检测技术的可靠性。

       4.慢性肾衰竭(CRF)

      在CRF的进展过程中,体内异常积蓄的代谢产物——尿毒症毒素起着重要作用。虽然该研究领域历史相对久远,但随着实验技术的不断进步,相关科研工作正日趋火热,而各类毒素的生物学效应正被不断明确。在既往人类及尿毒症大鼠模型的研究中,血清代谢组学分析也已成功鉴定出了吲哚硫酸盐、苯硫酸盐、马尿酸以及对甲苯硫酸盐等异常积蓄的代谢产物。有研究应用基于色谱质谱联用的技术平台,通过对慢性肾小球肾炎患者、未接受肾替代治疗的CRF患者以及正常人血浆磷脂代谢物的全谱分析,鉴定出6类80余种磷脂分子,且其中19种物质的变化与疾病分型密切相关。显示慢性肾小球肾炎所致CRF患者的磷脂代谢存在特征性改变,而这些代谢轮廓的变化能够用于慢性肾小球肾炎早期进展的监测,并为CRF进展的防治提供参考。在其另一项研究中,他们还发现肌酐、尿酸、两种必需氨基酸(色氨酸、苯丙氨酸)以及3种溶血磷脂胆碱等小分子代谢产物能够用于CRF的早期诊断,具有极大的临床研究价值。

        5.技术展望

       肾脏病是一种易累及全身并造成机体内环境紊乱的复杂病种。代谢组学的出现不仅提供了一种新的技术平台,更提供了一种从“终点”出发开展系统生物学研究的可能。随着代谢组学技术在肾脏病研究中的深入应用,其成果必将为深入理解各类肾脏病的病理生理机制、筛选实用的生物学标志物以及寻找有效的治疗靶点提供极大的帮助。

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