转录组学

解读10分lncRNA文献 4步法研究lncRNA功能

今天解读的这篇文章发表在2013年6月的《nature communications》上。
作者利用二代测序研究了单核细胞系受细菌脂多糖应激后lncRNA的表达变化。然后通过knock out实验验证了两条lncRNA的潜在功能。
首先,我们来看看这篇文章的思路,其实功能研究文章的核心思路很简单,只有四步。
但是最核心就是第三步:找到目标分子。而这篇文章找的目标分子是lncRNA,而且是enhance lncRNA,最后还证明的确有功能。
怎么找目标分子,首先分析文章主线:
这篇文章是10分的,内容很多。但文章的主线很简单,只有三步:
       1)处理和测序:利用细菌脂多糖处理细胞系,激发炎症反应,然后进行lncRNA测序
       2)lncRNA数据的分析:mRNA差异分析 → 找到关键应答的编码基因 →  以编码基因为线索找到候选lncRNA
       3)目标lncRNA功能分析与验证
这篇研究之所以能发10分关键在于第二步
       1)如何将lncRNA 扯到 enhance RNA;
       2)如何将从大量lncRNA 中筛选有潜在功能意义的lncRNA
接下来,我们就从第二步出发,看看作者是怎么一步步找到目标lncRNA的。
文章数据分析主线
第二步:lncRNA数据的分析
我们都知道,lncRNA是非编码的,要分析推测lncRNA的功能,只能利用编码gene为线索。所以大部分lncRNA功能研究的文章,都符合“mRNA → lncRNA”的逻辑思路。
最常用的线索其实也就两条:
       1)lncRNA 和关键编码基因的位置关系;
       2)共表达关系。由于这个研究只测了两组数据(处理组和对照组),无法计算相关系数,所以mRNA和lncRNA位置关系就是最核心的信息的。
那么,作者又是如何找到目标lncRNA的呢?
1、RNA-seq结果表明细菌脂多糖引起先天免疫应答
一个与炎症反应相关的基因IL1β在炎症反应下表达第二高。文章后续会解释为什么以这个基因为线索找lncRNA。
2、lncRNA的分析
除了常规的lncRNA差异表达分析, lncRNA与mRNA位置关系分类等内容,文章关键的一点是将lncRNA 和 enhance RNA联系在了一起。
(1)enhancer RNA
作者尝试判断哪些lncRNA 位于增强子区(enhancer),为潜在enhancer RNA(点击了解enhancer RNA)。
小科普:enhancer一般被H3K4me1修饰,而promoter主要被组蛋白H3K4me3修饰。因此H3K4me1/H3K4me3的比例,可以是区分promoter 和enhancer。
文章的做法:下载encode chip-seq数据,判断lncRNA是否来源enhancer区域, 最后以H3K4me1/H3K4me3 比例为大于1.2 和或小于0.8,判断lncRNA来源enhancer还是启动子。
(2)双向转录本
当然,文章还顺带分析了一下,看看哪些lncRNA是双向转录本(RBT)
小科普:大部分转录本都只从一条链转录组,而双向转录本是两条链均转录组
(3)差异表达的lncRNA的被关键转录因子调控
NFkβ是一种与炎症反应相关的转录因子,作者通过分析发现,差异表达mRNA、can-lncRNA、eRNA的promoter区普遍存在NFkβ的结合位点。
3、目标lncRNA的选择
作者特别关注了与编码基因——炎症介质因子IL1β相邻(距离 5k)的两条lncRNA,一条为RBT,一条为enhancer RNA;
选择编码基因IL1β为线索,筛选候选lncRNA的原因:
a)在炎症条件下, IL1β表达第二高;
b) IL1β之前的研究表明,在炎症应答反应中很重要;
c)周边有两条差异表达的lncRNA,而且一条是enhancer RNA,一条是RBT。
第三步、lncRNA的功能分析
1)用多点QPCR的方法,证明两个lncRNA与其1L1β表达量的相关性(虽然二代测序的样本过少,不足以进行相关性就计算,但可以使用Qpcr补充);
2)用CHIP-QPCR证明,在炎症条件下关键转录因子NFkβ可以结合在两个lncRNA的promoter区。
3)确定两个lncRNA起作用的亚细胞位置;
4)采用knock down技术验证两个lncRNA对IL1β表达的影响;
小  结
这篇文章是典型的lncRNA功能分析文章,有几点值得我们借鉴的:
1)以mRNA为线索,找lncRNA,是lncRNA功能研究的主要思路。当然,实际研究的时候,可能也无法做到一发命中。所以多选几个候选lncRNA,可以更好的的验证出一个有重要功能。
2)lncRNA后期功能验证,思路和编码基因是相似的,工作量自然也相似。但从现在研究热点来说,发现新的有功能的lncRNA,发高分文章的概率要更大。所以,老师只要经费许可,建议进行lncRNA测序,这样既可以分析样本中mRNA,又可以分析lncRNA,得到更多的信息。
3)这篇文章由于测序样本较少,所以只利用了lncRNA和mRNA的位置关系,即潜在的顺式作用(cis)。如果要研究非相邻的lncRNA与mRNA的关系,则要考虑使用多样本构建共表达网络,寻找潜在的反式作(tans)关系。
后续的文章解读中,我们会继续分享这样的案例。






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