转录组学

关于全转录组测序研究的9问9答|迷茫的点都在这

对于从事非编码RNA研究的同僚们来说,难免会对全转录组测序技术存在疑问。今天,小编为大家整理了有关全转录组测序研究的9问9答,帮你解决疑惑。

Q1

基于高通量测序的全转录组检测技术优势及应用是什么?

全转录组,指的是特定细胞在某一状态下所有转录产物的集合,包括了mRNA和非编码RNA,例如lncRNA,miRNA,circRNA等。全转录组测序仅需构建两种文库(small RNA文库和去核糖体的链特异性文库)便可同时分析4种RNA(miRNA,lncRNA,mRNA,circRNA)的信息。一方面节省样本量,另一方面使用同一批次样本提高研究结果可比性。

近些年,RNA研究领域发现多种非编码RNA(lncRNA , circRNA)可作为竞争性内源RNA(competitive endougenous RNA,ceRNA)参与基因的表达调控,ceRNAs可以通过与mRNA竞争结合miRNA来调节基因转录本的翻译。

全转录组分析便是针对一份样品同时分析mRNA,lncRNA,circRNA和miRNA之间的联合调控关系,全面构建精细的RNA调控网络,4种RNA两两间关联分析和两者以上ceRNA网络调控分析,不仅可以解释生物学现象背后的网络调控机制,而且能够缩小筛选范围,挖掘关键基因。

全转录组分析的主要目的是了解不同类型转录产物之间的行为和机制,具有分析内容更加全面,可靠性更高等优点,广泛应用于免疫机制、疾病领域、发育进化研究、致病机理和药物靶标等研究。

Q2

转录组测序可以同时测到mRNA、lncRNA、miRNA以及circRNA吗?

我们通常所说的转录组测序只能测到mRNA。但全转录组测序通过构建两个测序文库(small RNA文库和去核糖体的链特异性文库,该文库基础上分析circRNA)可以测到以上4种RNA。

Q3

如何实现LncRNA靶向mRNA预测?

lncRNA靶基因预测主要有2种方式:cis作用靶基因预测和trans作用靶基因预测。

cis作用靶基因预测,基于co_located分析原理,认为lncRNA的功能与其坐标临近的蛋白编码基因相关,位于编码蛋白上下游的lncRNA可能与启动子或者共表达基因的其他顺式作用元件有交集,从而在转录或者转录后水平对基因的表达进行调控。判断一个lncRNA具有cis调控作用通常要同时满足以下几个条件:1)附近的基因表达情况与其保持一致;2)该基因失活后会影响周围基因的表达;3)会影响附近同一位点的基因表达。

trans作用靶基因预测,基于co_expressed分析,认为lncRNA的功能跟编码基因的位置没有关系,而与其表达量具有相关性。也就是说,当lncRNA与一些距离较远的基因在表达量上存在正相关或负相关的情况时,就可以通过样本间lncRNA与蛋白编码基因的表达量相关性分析或WGCNA共表达分析来预测其靶基因。lncRNA的trans作用靶基因预测只适合于样本量大的情况,如果样本量太少(6个以下),分析结果不可靠。

Q4

预测的部分lncRNA序列和mRNA序列一致,怎么解释?

1、数据库中没有将sense的lncRNA去除,sense类型的lncRNA是与mRNA存在一定程度的overlap。

2、如果lncRNA与mRNA位置完全一致,需要考虑是否分别位于正链和负链,lncRNA与mRNA可能存在位于不同的链上,但碱基完全互补的情况。

Q5

如何实现lncRNA筛选,具体操作方法是什么?

lncRNA(长链非编码RNA)是一类转录本长度超过200nt,不编码蛋白的RNA分子。基于拼接结果,根据lncRNA的结构特点以及不编码蛋白的功能特点,设置一系列严格的筛选条件。通过以下5步的筛选,将筛选所得lncRNA作为最终的候选lncRNA集进行后续分析。

筛选步骤:

step1: 对所有样品拼接得到的转录本使用cuffcompare软件进行合并,选择同时被两种拼接软件鉴定到,或者同时出现在至少两个样品中的转录本;

step2: 选择转录本长度 =200bp;

step3: 按照转录本FPKM值对转录本进行筛选

step4: 若该物种存在已知lncRNA数据,首先通过cuffcompare软件,将前一步得到的转录本与已知lncRNA进行比较,得到与已知lncRNA相同的转录本。这一部分转录本直接纳入最终的lncRNA集,不再进行后续筛选。之后,通过与该物种已知非lncRNA及非mRNA类型(rRNA, tRNA, snRNA, snoRNA, pre-miRNA, pseudogenes等)的转录本进行比较,筛除那些与以上已知转录本相似或相同的转录本。若无已知lncRNA数据,则直接进行与该物种已知非lncRNA及非mRNA类型转录本的比较;

step5: 通过与已知mRNA进行比较,并利用cuffcompare分析结果中class_code信息筛选候选lincRNA,intronic lncRNA, anti-sense lncRNA等类型的转录本用于后续定量分析。

Q6

lncRNA作用机制是怎样的?

长链非编码rna的作用机制非常复杂,至今仍有许多未知领域。根据已有的研究,lncRNA的作用机制主要有以下几种:

1、在编码基因上游启动子区发生转录,干扰下游基因的表达;

2、抑制RNA聚合酶II或者介导染色质重构以及组蛋白修饰,影响下游基因的表达;

3、与编码蛋白基因的转录本形成互补双链,干扰mRNA的剪切,形成不同的剪切形式;

4、与编码蛋白基因的转录本形成互补双链,在Dicer酶的作用下产生内源性siRNA;

5、与特定蛋白质结合,lncRNA转录本可调节相应蛋白的活性;

6、作为结构组分与蛋白质形成核酸蛋白质复合体;

7、结合到特定蛋白质上,改变该蛋白质的细胞定位;

8、作为小分子RNA(如miRNA、piRNA)的前体分子。

Q7

lncRNA需要做哪些验证实验?

验证方法:

1、表达量验证,通过荧光定量验证差异基因的表达水平,是否和测序结果一致。

2、原位杂交(FISH)首先看锁定的lncRNA细胞的位置,再推断它的功能。

3、功能缺失实验:利用siRNA、shRNA、反义核酸等方法沉默lncRNA,观察干预后对细胞增值、凋亡、侵袭、转移、染色体等的影响,验证lncRNA靶基因的表达情况。

4、功能获得性实验:构建lncRNA过表达载体,观察过表达lncRNA后对细胞增殖、凋亡、侵袭等的影响,验证lncRNA靶基因的表达丰度。

5、过表达或敲除实验,假如lncRNA定位到细胞核,缺失后发现预测的靶基因表达水平升高,推测lncRNA可能与转录因子(蛋白)结合抑制DNA的转录;或lncRNA定位于细胞质中,过表达或缺失实验发现一些蛋白活性升高或降低,推测lncRNA可能和一些蛋白结合发挥作用。

如何实施lncRNA与蛋白结合的验证:设计探针利用免疫磁珠富集lncRNA,富集产物进行lncRNA和蛋白解离,利用质谱鉴定结合产物;若已知某个蛋白与RNA结合,可以采用抗体富集蛋白,产物进行蛋白与RNA解离,对RNA进行测序(RIP-seq技术)。

 

Q8

circRNA如何鉴定?怎么进行验证?

基于lncRNA测序结果使用两种软件对circRNA进行筛选,鉴于circRNA鉴定存在假阳性高的现象,对两款软件(find_circ和 CIRI2)鉴定出的circRNA的结果进行合并,并根据circRNA在染色体上的位置,对两款软件鉴定的结果取交集。最后对候选circRNA进行junction reads数的过滤,保留具有junction reads支持的circRNA。

验证:根据junction reads设计相向与相对的两对引物,用cRNA与gDNA进行半定量的验证。如图:

Q9

实现ceRNA调控网络构建的基础是什么?

lncRNA具有广泛的调控作用,不仅能够直接调控DNA的结构、RNA的转录和翻译,而且具有miRNA结合位点,可以作为miRNAspong竞争性地结合miRNA,抑制miRNA对靶基因的调节作用,从而间接地调控基因表达。基于ceRNA理论,寻找拥有相同miRNA结合位点的lncRNA-gene pairs,构建以lncRNA为连接、miRNA为核心、mRNA为靶标的lncRNA–miRNA-gene pairs,构建ceRNA调控网络。

非编码RNA中,circRNA也具有miRNA结合位点,可以作为miRNAspong竞争性地结合miRNA, 抑制miRNA对靶基因的调节作用,从而间接地调控基因表达。基于ceRNA理论,寻找拥有相同miRNA结合位点的circRNA-gene pairs,构建以circRNA为连接、miRNA为核心、mRNA为靶标的circRNA-miRNA-gene pairs,构建ceRNA调控网络。

在全转录组层面,利用ceRNA调控网络,揭示ncRNA调控基因表达新机制。

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