蛋白质组学

自己翻译的罗氏tunel检测细胞凋亡试剂盒说明书

注意:Label 溶液含有甲次砷酸盐和二氯化钴,严禁吸入和食入。 反应悬浮物收集于密闭、不易碎、有明确标识的容器中,按有毒废物处理。

试剂盒组成:
小瓶/盖子 1 蓝色 标签 酶溶液 内容物 大肠杆菌重组牛胸腺末端脱氧核苷酸转移 酶,在 storage buffer 中 10×conc. 5×50ul 在 reaction buffer 中的核苷酸混合物 1×conc. 5×550ul 抗荧光素抗体,绵羊 Fab 片段,连接有辣根 过氧化物酶 Ready-to-use 3.5ml

2 紫色

标记溶液

3 黄色

转化-POD

需要自己配置的其他物品:

除上表所列试剂外,还需准备以下溶液。

下表列出每步所需物品概览: 步骤 样品准备 section 3.2 黏附细胞, 细胞涂片和细 胞 离 心 涂 片 准 备 section3.2.1 冰冻组织 section3.2.2.2 Washing buffer:磷酸缓冲液 PBS* Bloking buffer 封闭缓冲液:溶于甲醇的 3%H2O2 Fixation solution 固定剂:溶于 PBS 的 4%多聚甲醛, ph7.4,新鲜配制 Permeabilisation solution 渗透溶液:溶于 0.1%柠檬酸钠 的 0.1%Triton X-100,新鲜配制(6)

固定剂 二甲苯和乙醇(浓度:95%,90%,80%,70%,溶于双 蒸水中) Washing buffer:PBS* 蛋白酶 K*,不含核酸酶,工作浓度:[10-20ug/ml,溶于 10mM Tris/HCL 中,ph7.4-8] 替代处理方案 ※渗透溶液: (0.1%Triton1) X-100,溶于 0.1%柠檬酸 钠的,新鲜配制 ※胃蛋白酶*(0.25%-0.5%,溶于盐酸中,ph2)或胰蛋 白酶*,0.01N HCL,不含核酸酶 ※0.1M 柠檬酸缓冲液,ph6,微波照射 微球菌核酸酶或 设备 试剂

石蜡包埋组织 section3.2.2.1

标记步骤 section3.3 阳性对照 section3.3.1

DNase I,重组,级别 1* 黏附细胞, 细胞涂片和细 胞离心涂片和组织 section3.3.2 Difficult tissue 困难组织 Parafilm 石蜡封 口膜或盖片 湿盒 塑料容器 微波 湿盒 Washing buffer:PBS*

Citrate buffer 柠檬酸盐缓冲液,0.1M,ph6.0 Washing buffer:PBS* Tris-HCL,0.1M ph7.5,含 3%的 BSA*和 20%正常牛血 清 Washing buffer:PBS* DAB Metal Enhanced Substrate Set*DAB 金属增强底物* 或 POD 底物替代物 光镜镜检封固剂

信号转换 section3.4 湿盒 Parafilm 石蜡封 口膜或盖片

产品概述:

特异性:TUNEL 反应优先标记凋亡产生的 DNA 链断裂,从而辨别凋亡与坏死、以及由抑 制细胞生长的药物或放射线产生的 primary DNA 链断裂 实验干扰:假阴性:在某些型式的凋亡细胞中 DNA 链断裂可能缺失或不完全。空间位阻, 如细胞外元件可能阻止 TdT 到达 DNA 断裂处。两种情况均能产生假阴性。 假阳性:在坏死晚期,可能产生大量的 DNA 片段 DNA 链断裂也可能在具有高增殖和代谢活动的细胞中出现。

两种情况均能产生 假阳性。为确认细胞死亡的凋亡型式,应认真进行每种细胞的形态学检查 凋亡过程中产生的形态学改变尤其特征形式,因此,对于可以结果进行解释时, 细胞形态评估是一项重要的参数。

样本:细胞离心涂片和细胞涂片 在 chamber slides 上培养的黏附细胞 冰冻或福尔马林固定、石蜡包埋样本 分析时间:2-3 小时,除外培养、固定和渗透 检测次数:一个试剂盒 50T 试剂盒存储/稳定性:未开封试剂盒储存于-15~-25℃可稳定至标签上标明的效期。 试剂 TUNEL 反应混合物 转化-POD 储存和稳定性 TUNEL 反应混合物应在用前临时配制,不能储存 TUNEL 反应混合物用前应置于冰上 一旦融化转化-POD 溶液后,应储存于 2-8℃(最长稳定 6 个 月) 注意:禁止冰冻结冰

优点:
优点 灵敏 特异 快速 简便 灵活 特点 在单个细胞水平检测细胞凋亡的早期间断 对坏死来说,优先标记凋亡 分析时间短(2-3h) 试剂稳定、优化,没有稀释步骤 适合于固定细胞核组织,允许堆积、贮存和转运样本

双染可以鉴定细胞凋亡的类型和阶段 Function-tested 功能检查 对于大量的批号来说,每一批号均进行了功能检测

步骤和所需材料:

2 样品准备
2.1 黏附细胞、细胞涂片和细胞离心涂片 需准备的其他试剂:Washing buffer:磷酸盐缓冲液(PBS) Blocking buffer 封闭溶液:甲醇稀释的 3% H2O2 Fixation solution 固定溶液:PBS 配制的 4%多聚甲醛,ph 7.4,新鲜配制 ) Permeabilisation solution 渗透液: 0.1%Triton1 X-100 溶于 0.1%柠檬酸钠 溶液中,新鲜配制 步骤:下表描述了细胞固定、内源性过氧化物酶封闭和细胞渗透过程。 注意:固定和渗透另外两个细胞样本用于银杏和阳性对照 步骤 1 2 3 操作 用新鲜配制的固定液固定风干的细胞样本,1h,15-25℃ 用 PBS 冲洗玻片 用封闭液孵育,10min,15-25℃

用 PBS 冲洗玻片 用渗透液孵育,2min,置于冰上 2-8℃ 按 3.3 操作

2.2 组织部分 2.2.1 福尔马林-包埋组织 福尔马林包埋组织的预处理:可按 4 种不同的方式预处理。如用蛋白酶 K,不含核酸酶,浓 度、孵育时间和温度应按组织类型优化 注意: 只用罗氏应用科学的蛋白酶 K, 因其经检测不含核酸酶, 核酸酶可导致假阳性。

另外 3 中替代方法在下表中描述(step 2) 需准备的其他试剂:二甲苯和乙醇(浓度:95%,90%,80%,70%,溶于双蒸水中) Washing buffer:PBS 蛋白酶 K,不含核酸酶,工作浓度:[10-20ug/ml,溶于 10mM Tris/HCL 中,ph7.4-8] 替代处理方案 ) ※渗透溶液:0.1%Triton1 X-100,溶于 0.1%柠檬酸钠的,新鲜配制 ※胃蛋白酶* 0.25%-0.5%, ( 溶于盐酸中, ph2) 或胰蛋白酶*, 0.01N HCL, 不含核酸酶 ※0.1M 柠檬酸缓冲液,ph6。

微波照射 步骤:下表描述了用蛋白酶 K(不含核酸酶)和 3 中替代方法预处理福尔马林-包埋组织的 方法 注意:加入额外的组织用于阴性和阳性对照 步骤 1 2 操作 按照标准操作脱蜡和再水化组织(e.g. 60℃加热,二甲苯浸洗,一系列梯度酒精和双 蒸水再水化 用蛋白酶 K 工作液于 21-37℃中孵育 15-30min 替代方法 1.渗透液 2. 胃蛋白酶或胰蛋白酶 3.微波射线 孵育 8 min 37℃孵育 15-60min 将玻片置于含有 200ml 0.1 M 柠檬酸盐缓冲液,ph6.0 的塑料容器中 350 W 微波放射 5 min 操作

用 PBS 冲洗两次 按 3.3 操作

2.2.2 冰冻组织处理

3 标记草案
3.1 开始之前 准备 TUNEL 反应混合液:每一对管子(小瓶 1:酶溶液,小瓶 2:标记溶液)足以用于 50ul 反应体系的 10 张片子,和 2 个 50ul 标记溶液的阴性对照。 注意: TUNEL 反应混合液应于用前临时配制, 不能储存。 TUNEL 反应混合液用前置于冰上

操作 取 100ul 标记溶液(小瓶 2)用于阴性对照 加入总量 50ul 的酶溶液(小瓶 1)于 450ul 的标记溶液中,以获得 500 ul TUNEL 反应混合液 充分混匀

需准备的其他试剂:微球菌核酸酶或 DNase I,重组,级别 1* 对照:每次实验应包含两个阴性对照和一个阳性对照应 阴性对照 阳性对照 孵育固定和渗透的细胞于 50ul/标记溶液中(无末端转移酶) ,替代用 TUNEL 反应混合液孵育 孵 育 固 定 和 渗 透 的 细 胞 于 微 球 菌 核 酸 酶 或 DNase I , 重 组 , 级 别 1 中 (3000U/ml-3U/ml 于 50mM Tris-HCL 中, ph7.5, 10mM MgCL2, 1mg/ml BSA) 10min,15-25℃,以诱导在标记前 DNA 链断裂

3.2 黏附细胞、细胞涂片、细胞离心涂片和组织标记草案 需准备的其他设备和试剂:Washing buffer:PBS 湿盒 Parafilm 石蜡封口膜或盖片 步骤:参考下表 步骤 1 2 3 操作 用 PBS 冲洗两次 使样品周围区域变干 加入 50ul TUNEL 反应混合液于样品上 注意: 阴性对照加入 50ul 标记溶液。 确保 TUNEL 反应混合液均匀分布于单层细胞 上,避免蒸发丢失。孵育时样品上应覆盖 Parafilm 石蜡封口膜或盖片 在湿盒、暗室中加盖孵育 60min,37℃ 用 PBS 冲洗 3 次 可在样品上加入 1 滴 PBS, 于荧光显微镜下观察。 激发光波长 450-500 nm, 515-565 在 nm(绿色)范围类检测

3.3 困难组织标记草案(略) 3.4 信号转换 需要准备的其他设备和试剂:Washing buffer:PBS 湿盒 Parafilm 石蜡封口膜或盖片 DABA 底物或 POD 替代底物 光镜镜检封固剂 步骤:按照下表操作 步骤 1 2 操作 使样品周围区域变干 加入 50 ul 转化-POD(小瓶 3)于样品上

注意:确保转化-POD 溶液均匀分布于单层细胞上,避免蒸发丢失。孵育时样 品上应覆盖 Parafilm 石蜡封口膜或盖片 3 4 5 6 7 8 在湿盒中孵育 30min,37℃ 用 PBS 冲洗 3 次 加入 50-100ul DAB 底物或 POD 替代底物 于 15-25℃孵育 10min 用 PBS 冲洗 3 次 用玻璃盖片封固(e.g. 用 PBS/甘油) ,光镜下检查 替代方法:光镜检查前可复染

4. 附件: 4.1 Troubleshooting 问题 非特 异性 标记 步骤/试剂 包埋组织 可能原因 紫外辐射用于包埋组织的聚 合(e.g.异丁烯酸盐导致 DNA 链断裂) 建议 使用不同的包埋材料或不用的聚合 试剂

固定

酸性固定剂 (e.g. 甲安菲他明, 使用 4%多聚甲醛 Carnoy’s 使用福尔马林或戊二醛 固定剂) TdT 浓度太高 内源性 POD 活性 抗-银光素-POD 非特异性连接 用 TUNEL 稀释缓冲液 1:2 至 1:10 稀释 TdT 浓度 细胞渗透前, 浸入 3% H2O2 甲醇稀 释液 10min,封闭内源性 POD 用正常抗绵羊血清封闭 用含 3% BSA 的 PBS 封闭 20min 减少转化溶液浓度 50% 取得器官后立即固定组织

通过肝静脉灌注固定剂 用含有 ddUTP 和 dATP 的溶液封闭 使用甲醇固定,但同时应考虑甲醇 固定可能降低灵敏度 用 TUNEL 稀释缓冲液使标记混合 物浓度降低 50% 细胞渗透前, 浸入 3% H2O2 甲醇稀 释液 10min,封闭内源性 POD 用正常抗绵羊血清封闭 用含 3% BSA 的 PBS 封闭 20min 减少转化溶液浓度 50% 支原体检测试剂盒 双染,e.g.用 Annexin-V-Fluos 注 意 : Measuring via microplate reader not possible because of too high background.

TUNEL 反应 转化步骤

核酸酶

某些组织(e.g. 平滑肌,组织 准备后很快出现 DNA 断裂) 某些酶仍有活性 福尔马林固定导致含有黑色 素前体的细胞黄染 对于乳腺癌,标记混合物浓度 太高 内源性 POD 活性 抗-银光素-POD 非特异性连接

背景 高

固定 TUNEL 反应 转化步骤

样品

支原体污染 高增殖细胞 (责任编辑:大汉昆仑王)

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