蛋白质组学

蛋白质相互作用的研究

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蛋白质研究技术

蛋白质是生命活动的执行者,细胞内的生理变化都是通过蛋白质来实现的。但是生命活动中各项功能和行为不是由单一的蛋白质来完成的,需要蛋白质与蛋白质,蛋白质与核酸之间的相互作用来实现的。蛋白-蛋白互作网络与转录调控网络对调控细胞及其信号有重要意义。于是对于蛋白之间相互作用的研究也变的很重要,关于研究方法也是层出不穷。

在我们实验研究的过程中主要用到以下几种技术:

1.酵母双杂交(Y2H)

2.Pull-down技术

3.免疫共沉淀技术(Co-IP)

4.亚细胞共定位技术

5.噬菌体展示技术(PDT)

6.荧光共振能量转移技术(FRET)

7.双分子荧光互补技术(BIFC)

其中实验室比较常用的研究方法主要是前三种。这里对酵母双杂交技术略作介绍和评述。

原理:

酵母双杂交系统由Fields和Song等首先在研究真核基因转录调控中建立的。酵母的半乳糖苷酶基因的转录激活因子GL4有两个独立的结构域 :N末端的DNA结合域(BD)和C末端的转录激活域(AD)。BD与DNA分子结合,AD激活下游基因的转录,只有两者在空间上充分接近才能激活下游基因的转录。于是将要研究的两个蛋白分别与BD和AD融合,如果两个蛋白有相互作用则AD和BD在空间上会接近进而激活下游报告基因的转录。

操作步骤:

(1)首先构建已知蛋白的cDNA序列为诱饵,与DNA结合域融合(2)将待筛选的蛋白的cDNA序列与转录激活域融合,构建成文库质粒(3)将这两个质粒共转化到酵母细胞中(4)通过检测下游报告基因的表达筛选或确认蛋白相互作用。

优缺点:

优点:是可以在文库中可以高通量筛选与目的蛋白相互作用的蛋白。

缺点:是假阳性多,还需要其他方法相互印证,不适用于所有的蛋白。

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