蛋白质组学

cine-SDS-PAGE 电泳分析小分子多肽

作者:王旭, 何冰芳, 李霜, 韦萍, 欧阳平凯(南京工业大学制药与生命科学学院,江苏南京 210009)

常规Tris-甘氨酸-SDS-PAGE 电泳分析分辨大分子物质的相对分子质量范围在10~200 kDa , 对于相对分子质量小于10 kDa 的多肽分辨率低[1 ] 。Swank 等在含有SDS 的凝胶中加入8 mol·L-1的脲,但分离效果不甚理想, 且重现性较差。

Lanzillo 等发现在Laemmli 系统和仅在样品和电极缓冲液中有SDS 的不连续缓冲系统中,低分子量多肽常常堆积在浓缩胶中[2 ] ,之后Schagger 等[3 ] 又进行了系统地研究和探索,能够分离较大相对分子质量范围内的蛋白质。

随着生物技术的飞速发展和基因工程药物的大量涌现,具有高生物活性的小分子多肽的分离、纯化和鉴定技术极为重要。本文报道采用Tris2Tricine 缓冲体系,对SDS-PAGE 方法的各个环节进行了改进,在较低的丙烯酰胺浓度下取得了较理想的结果。

1 材料和方法

1. 1 试剂和仪器SDS为华美生物工程公司产品;丙烯酰胺(分析纯) 为上海绿鸟科技发展有限公司产品;N2N’甲叉双丙烯酰胺( 分析纯) 为Fluka 公司产品; Tris 为Promego 公司产品; Tricine 、TEMED 、过硫酸铵均为上海生工AMRESCO 分装产品;脲(分析纯) 为无锡市民丰试剂厂产品;肽分子量标准的分子量范围1 060~26 600 为美国Sigma 公司产品。EPS604 稳压稳流电泳仪(南京科宝仪器研究所) ;小型垂直电泳附件模具为北京六一仪器厂生产。

1. 2 方法

1. 2. 1 电泳贮存液的配制 见表1 和表2 。

1. 2. 2 胶的制备

在垂直电泳附件模具中,按表3 给出的数据依次灌注分离胶、间隙胶和浓缩胶,采用4 种不同的分离胶配比方法,进行比较实验。

1. 2. 3 电泳

分别按表1 的组成加阳极及阴极缓冲液, 先60 V 电泳1 h, 当样品进入分离胶时,将实验的电压分别升到100 V,85 V,95 V,95 V 进行比较,直至样品中染料迁移至离下端1cm 时停止电泳。

1.2.4 固定、染色和脱色

取出平板中的凝胶立即浸泡于固定液(50 % 乙醇,10 % 冰乙酸) 中固定1h, 再将固定后的凝胶置于45℃的染色液(1 g·L-1考马斯亮蓝R250的25%乙醇,8%冰乙酸) 中浸泡15~30 min , 然后用蒸馏水将凝胶淋洗一次,最后,多次变换脱色液(25%乙醇, 8%冰乙酸,以上均为体积分数) ,直至凝胶上背景脱净为止。

2 结果和讨论

4种不同类型胶的蛋白标准分离结果。对后两种类型胶的分离结果以其MW对数(lgMW) 和在分离胶中的相对迁移率(Rf)进行了直线回归分析(图2) ,相关系数r分别为01896 和01892 。

可以看出,分离胶0.1T,3 % C 的SDS-PAGE 电泳可以分析分辨5 kDa 以上的蛋白,该类型的胶相对于其它类型胶来说产生的热量较小,但是低于5 000 Da 的多肽很难分辨。

分离胶0.165T,3%C的SDS-PAGE可比较清楚地分离3 kDa 以上的多肽,而1 kDa 相近的蛋白带无法观察,若低于5 000 Da 的多肽分离不很重要的话,完全可以省去间隙胶的使用;分离胶0.165 T ,6 % C (不含脲) 的SDS-PAGE电泳对于1~20 kDa 的多肽有很好的分辨率。在第4种类型的分离胶中添加脲,如Swank 和

Munkres 所述,低于5 000 Da 的蛋白条带清晰度增加。脲使用与否的主要区别在于蛋白的具体性质,有些蛋白没有脲时分离效果更好,但是有些蛋白的分离就需要添加脲时才能更好分辨。但在一般小分子肽的分离中,有无脲的添加对电泳结果无明显影响。

根据相对迁移率与标准蛋白相对分子质量对数的曲线(图2) 可见,5种蛋白的计算相对分子质量精确度为±10 %, 属于电泳法测定相对分子质量的正常误差范围。

仅有最低相对分子质量标准蛋白( Mw1 060)的计算值与实际相对分子质量有一定差异,这主要是因为小肽的相对分子质量越小,其固有电荷及其构象对泳动率的影响就越大。以上结果表明该法在实际工作中可为研究者提供较为可靠的分离条件及分析结果。

SDS-PAGE电泳的有效分离范围取决于聚丙烯酰胺的浓度和交联度,相对分子质量低于10 000的染色和脱色过程中未使用甲醇小分子肽即使用较高浓度的聚丙烯酰胺也不能完全分离。

我们通过比较发现,采用分离胶0.165 T, 6 %C (含或不含脲) 的梯度胶电泳,即可把标准品的6 条带显示得非常清楚,上样量小,重复性好。固定、染,且在电泳后通过加热快速染色避免了凝胶的膨胀变形, 而且甲醇会使SDS-蛋白复合体中的SDS 游离出来而导致一些小分子多肽的扩散、丢失。

在含SDS 缓冲液的样品中, 小分子多肽的浓缩是较困难的,因为小分子多肽SDS 形成的复合体具有与SDS 本身类似的电荷和大与小,因此浓缩对于小分子多肽的SDS-PAGE 来说就成了一个突出的问题[4] 。

我们采用的方法中利用Tricine 缓冲体系,分离胶和浓缩胶中采用相同的pH值,并在较低的丙烯酰胺浓度的电泳条件下,使小分子多肽能够有效地压缩和去压缩。而且电泳体系中不使用甘氨酸和脲,可以为后来的氨基酸序列测定免除干扰。

(责任编辑:大汉昆仑王)

(0)

热评文章

发表评论