蛋白质组学

重组胰蛋白酶最适 PH 和 PH 稳定性

样品:重组胰蛋白酶,比活 4500USP u/mg pro.,上海雅心生物技术有限公司,纯度如图 1 所示。BAEE,Sigma.

图 1. 重组胰蛋白酶的纯度的 SDS-PAGE 鉴定

1. 最适 pH 的研究

准备 pH 为 3~12 的底物 BAEE(0.25 mM),分别测定 rPT 纯酶液的活性,最后结果表示为测定数值占最高酶活的百分比。缓冲液成分依次为 25 mM NaAc-HAc (pH 3~6),25 mM Tris-HCl (pH 7~8),25 mM Gly-NaOH(pH 9~12),所有缓冲液均为 25℃ 下配制。底物在 25℃ 温浴 10 分钟后,开始测活。

2. pH 稳定性的研究

取活性为 10 mg/ml 纯酶液,分别在 pH 3~12 缓冲液中稀释 10 倍,在 25℃ 下温浴 2 h,取样品测定酶活,以水浴前酶液初始活性作为 100%,计算残余活性。缓冲液依次为 25 mM NaAc-HAc (pH 3~6),25 mM Tris-HCl (pH 7~8),25 mM Gly-NaOH (pH 9~12),所有缓冲液均为 25℃ 下配制。

图 2. a, RPT 最适 pH 曲线; b, RPT 的 pH 稳定性

分别在 pH 3.0~12.0 不同的 pH 条件下,测定 rPT 活性。结果见上图 2a,最适 pH 范围是 7~11,而 pH 为 9.0 时测得 rPT 活性为最大值,这与天然提取的猪胰酶不同(天然胰酶最适 pH 为 7.6-9.0),几乎接近极值,确定该值为测活最适条件,但是底物在碱性条件易降解,所以底物尽量要现用现配。

分析不同 pH 环境对 RPT 活性的影响,如图 2b 所示,rPT 在 pH 3.0 NaAc-HAc 缓冲液里最为稳定。随着 pH 的升高,RPT 酶活的损失程度也随之提高。在测定 rPT 最适 pH 值时发现,pH≤5 底物条件下,RPT 蛋白几乎无活性,如图 2a 所示。在 pH≤5 的缓冲液中,2 小时后依然保持较高的活性。

说明在 pH≤5,RPT 稳定,自降解的速率大大降低,酶分子处于相对稳定的状态。此时把酶液转入到 pH 7.6 的测活体系中,此时酶分子的构象瞬间发生变化,重新暴露出活性位点,于是又恢复了活性。此外,RPT 对碱性环境有一定时间的耐受性,在 pH<9环境中,2小时后依然有80% 以上的酶活残余,从这一点讲,rPT扩大了胰酶的应用pH范围,有很大的意义。但是pH>10 环境中,活性损失非常快。

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