蛋白质组学

蛋白互作研究技术:「FRET」VS「Duolink PLA」

荧光能量共振转移 (FRET)

检测活体中生物大分子纳米级距离和纳米级距离变化的有力工具,广泛应用于生物大分子相互作用分析、细胞生理研究、免疫分析等。

原理

当供体荧光分子的发射光谱与受体荧光分子的吸收光谱重叠,并且两个分子的距离在 10nm 范围以内时,就会发生一种非放射性的能量转移,即 FRET 现象,使得供体的荧光强度比它单独存在时要低的多(荧光猝灭),而受体发射的荧光却大大增强(敏化荧光)。

应用

1、生物大分子结构和功能研究:细胞膜受体之间相互作用、细胞内分子之间相互作用、膜蛋白的定位修饰、检测酶活性变化等2、核酸杂交分析

3、免疫分析:不仅适用于小分子 (如半抗原),而且适用于大分子 (如蛋白质)。

特点

1、实验背影低,但抗原、抗体纯度要求较高;

2、简便的均相检测(不需要洗板),操作简单;

3、实验产物比较稳定,可用于固相分析或利用特殊的荧光显微镜进行单细胞分析,但需要特殊的辅助设备;4、应用灵活多样检测组合丰富,需要融合蛋白的表达5、可用于复杂环境下的分析,研究活细胞生理条件下研究蛋白质-蛋白质间相互作用。

6、有效的作为 1.0~10.0nm 距离范围。

Duolink PLA 技术

蛋白质全面分析技术,完成对蛋白质互作及其修饰的检测、定量以及确定细胞定位等

原理

Duolink?实验基于邻位连接技术(PLA),当一对 PLA probes 足够接近时(<40 nm)会产生 PLA 信号,由于 PLA probes 特异识别一抗,PLA 信号的强弱直接反映了蛋白表达量水平或蛋白互作的强度, 利用显微镜可以观察到 PLA 信号及其位置。

应用

1、检测稳定、瞬时和微弱的蛋白互作

2、检测蛋白的翻译后修饰

3、高灵敏性的检测低丰度蛋白的表达

特点

1、可用于未修饰的细胞和组织,可以检测单一的目标蛋白。

2、识别同一目标的两个不同抗原表位,灵敏度和精确度远高于单个表位识别。

3、通过一对邻位探针环化并且进行滚环扩增,更有利于信号的放大。

4、凭借探针锚定目标蛋白,从而准确的定位目标。

5、针对不同的细胞,组织进行比较和定量分析,能够自动的筛分靶分子。

综上比较,FRET 技术可应用于检测某一细胞中两个蛋白质分子是否存在直接的相互作用。实验材料简便样本量要求低,减少复杂操作导致的实验结果误差较大;低空间分辨率、高灵敏度及适用于复杂体系。

并且高时间分辨率,可以迅速的跟踪记录下 rds 甚至级时间内的距离变化,所以适用于酶的催化、肌肉收缩、信号传递、主动运输等方面的研究。可用于高通量筛选等技术优势。

目前,新开发出的标记方法有酶催化插入、荧光类似物等等。根据 FRET 技术的特点,它在均相荧光免疫分析及核酸分子杂交方面具有广泛的应用前景总之,FRET 技术以其独特的优越性,在今后的科研中,将与荧光显微镜结合,用于单个活细胞的分析,使人们对生命现象奥秘的探索向前迈进。

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