蛋白质组学

原核表达-Novagen产品

pET系列载体

之所以首先介绍Novagen公司的产品是因为用过它的pET系列载体,感觉很好用。Novagen的母公司是德国默克(Merck)公司,它是国际著名的化学及制药公司总部位于德国的Darmstadt,已有300多年的历史。已在全世界55个主要国家设立了分公司,其中在28个国家建有62个生产基地。

Novagen公司出品的pET系列载体是目前应用最为广泛的原核表达系统,已经成功地在大肠杆菌中表达了各种各样的异源蛋白。pET系列载体是利用大肠杆菌T7噬菌体转录系统进行表达的载体。

T7噬菌体具有一套专一性非常强的转录体系,利用这一体系中的元件为基础构建的表达系统称为T7表达系统。T7噬菌体基因编码的T7 RNA聚合酶选择性的激活T7噬菌体启动子的转录。它是一种高活性的RNA聚合酶,其合成mRNA的速度比大肠杆菌RNA聚合酶快5倍左右。并可以转录某些不能被大肠杆菌RNA聚合酶有效转录的序列。在细胞中存在T7 RNA聚合酶和T7噬菌体启动子的情形下,大肠杆菌宿主本身基因的转录竞争不过T7噬菌体转录体系,最终受T7噬菌体启动子控制的基因的转录能达到很高的水平。

T7噬菌体启动子的转录完全依赖于T7 RNA聚合酶,因此T7 RNA聚合酶的转录调控模式就决定了表达系统的调控方式。噬菌体DE3是λ噬菌体的衍生株,一段含有lacⅠ,lacUV5启动子和T7 RNA聚合酶基因的DNA片段倍插入其int基因中,用噬菌体DE3的溶源菌,如BL21(DE3)、HMS174(DE3)等作为表达载体的宿主菌,调控方式为化学信号诱导型,类似于Lac表达系统。

从开始涉及表达的时候可以根据是否要用基因本身的起始密码子进行选择,Novagen公司仅提供三个载体:pET-21(+),pET-24(+)和pET-23(+)。如果你打算利用载体的起始密码子,那么就有许多选择。

根据是否要可溶性表达,选择加有不同标记的载体。一般说来在大肠杆菌中不加标记外源蛋白都会以不溶的包涵体形式表达。为了让外源蛋白融合表达一般说来有三个策略:

与一个高度可溶的多肽联合一起表达,比如:谷胱甘肽S转移酶(glutathione S transferase,GST)、硫氧还蛋白(thioredoxin,Trx)和N利用质A(N utilization substance A,NusA)。

转入一个酶催化二硫键的形成,如:硫氧还蛋白,DsbA,DsbC。插入一个定位到周质空间的信号序列。

不同载体提供不同的标记,有的可以同时带有多个标记。如果你不希望在蛋白的N末端加入任何的多肽,你也可以选择用NdeⅠ直接从起始密码子后插入外源片断,或者在得到表达产物后利用蛋白氨基酸的酶切位点把多余的多肽切除。

以上载体都是采用抗生素抗性筛选,如果你希望用蓝白斑筛选可以使用pETBlue系列载体。在重组技术上,Novagen除了传统的酶切、连接方式外,还有不需要连接的克隆方式:Ligation-Independent cloning,简称LIC。

采用LIC方法的pET载体是线性化的,在末端有12-15个突出的碱基以在退火时和目的片断互补。在设计PCR扩增引物时加入与LIC载体互补的序列,PCR产物用3’→5’的内切酶消化出单链与载体互补的序列。通过这种方式就可以把目的片断定向、高效地插入LIC载体上。

一般的pET载体是先在不含DE3片段的菌株中进行克隆筛选,之后再把阳性克隆转化进入表达菌株,如BL21(DE3)中,通过IPTG诱导进行表达。而pETcoco载体它引入了低拷贝控制元件,F附加体上的oriS和repE元件与parABC共同作用下使质粒在细菌中保持单拷贝,这样即可以使质粒在细菌内稳定存在又可以减少外源蛋白对细胞的毒害作用。当我们需要大量表达时加入树胶醛醣诱导trfA基因表达,质粒在细胞内的拷贝数就可以增加到25-50。pETcoco载体同时兼容了DE3调控模型,在加入IPTG后诱导表达量达升高2500倍。

在保证质粒稳定性这一点上除了pETcoco的方法还有另一种方法就是将重组质粒转化进入含有T7 RNA聚合酶抑制剂的T7溶菌酶表达基因的菌株中,在含有pLysS的pLysE宿主菌内重组质粒的本底表达被进一步抑制,质粒可以更稳定地存在。

Novagen提供多种表达使用的菌株,为了提高表达量做出了各种改造,它们大致分为以下几个种类:

蛋白酶缺陷型

所有B菌株的衍生株都是lon蛋白酶和ompT蛋白酶缺陷型的,这包括有B834,BL21,BLR,Origami™ B,Rosetta™和Tuner™。因此在纯化时可以保持蛋白的稳定不被降解。BL21(DE3)是应用最多的表达的表达菌株。另外它的衍生株BLR(DE3)是recA-,RecA是大肠杆菌中介导同源重组的重要蛋白之一。它的缺失,可以保证质粒的稳定。

保证所有细胞以同样量进行表达

Tuner™株及它的衍生株(Origami™ B和Rosetta™)是BL21菌株的lacY1缺失突变型,在这些菌株中可以使蛋白以同样水平在所有细胞中表达。Lac渗透酶的突变使进入每个细胞的IPTG量都是一致的,这样使蛋白表达浓度可以随着IPTG浓度而改变。通过对IPTG浓度的控制可以使细胞微量表达或者大量表达。一般说来,低浓度表达有利于蛋白的可溶性和活性。

二硫键形成与溶解性增强

二硫键的形成对某些蛋白的可溶性起到重要的作用,而Novagen也专门设计了一些菌株是谷胱甘肽还原酶(gor)和/或硫氧还蛋白还原酶(trxB)缺陷型的,包括AD494,BL21trxB,Origami,Origami B和Rosetta-gami™。在这些菌株中表达蛋白,可以更大程度促进二硫键的形成,并使蛋白以可溶形式和有活性形式出现的可能增加。

稀有密码子的补给

不同物种有不同的密码子偏爱性,如果外源蛋白中含大量大肠杆菌的稀有密码子,特别当这些稀有密码子呈连续分布的时候,就会造成蛋白表达量极低,或者翻译提前终止。Rosetta™是为了表达真核蛋白而特别设计的,它含有大肠杆菌稀有的密码子tRNA,包括AUA,AGG,AGA,CUA,CCC和GGA。它们以氯霉素抗性的质粒形式存在。Rosetta系列是来自BL21lacY1,所以它具有BL21lacY1的所有特性。

硒蛋氨酸标记

B834是来源于BL21的蛋氨酸(met)营养缺陷型菌株。它在高度特异活性35S-met标记和晶体成像蛋氨酸标记中非常有用。

我们常用的培养基有LB、TB、M9、M9ZB,LB因为其成本低廉所以应用最为广泛,而Novagen有提供特殊的培养基Overnight Express™ Autoinduction System。使用这种培养基不需要按照传统方法先培养一段时间再加IPTG进行诱导,它可以直接进行过夜培养。在这种培养基中含有痕量金属,可以满足合成蛋白时对金属的需求。

同时提供除了各种氨基酸,这其中蛋氨酸是另外加入的。这样培养基可以满足细菌生长的各种需求,使细菌密度更高;可以自动诱导无需自己加IPTG;使蛋白更加容易溶于培养基中;并且如果需要的话,可以对蛋氨酸进行硒标记。

同时Novagen还有表达双外源蛋白的载体pCDFDuet-1 DNA 、pETDuet™-1 DNA 、pRSFDuet-1 DNA。这些载体含有两个不同多克隆位点,可以插入两个外源蛋白基因,利用单独的T7 启动子,乳糖操纵子和核糖体结合位点进行表达。载体转化进入合适的菌株中最多可以同时表达8个外源蛋白。

Novagen的原核表达载体可以说是一面金字招牌,有许多不同系列的载体、菌株供选择;与原核表达的各种相关产品都一应俱全,比如:载体、菌株、培养基、检测表达的抗体、纯化产品等

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