蛋白质组学

氰化高铁血红蛋白测定法

[目的与原理]

应用氰化高铁血红蛋白(HiCN)法,测定不同鱼类血红蛋白含量。

血红蛋白(Hb)被高铁氰化钾[K 3 Fe(CN) 6 ]氧化为高铁血红蛋白(Hi),Hi与氰离子结合成氰化高铁血红蛋白(HiCN),它在540nm有一吸收峰,通过测定其光密度而得血红蛋白含量。

[实验对象]

鲤、鲫或草鱼。

[ 试剂 与器材]

分光光度计,试管若干,移液管(5ml),吸血管(20u1),注射器,凹瓷盘,试管,试管架,蒸馏水,75%酒精,棉球,纱布,抗凝剂(1%肝素钠溶液或10%草酸钾溶液)。

氰化高铁血红蛋白稀释 试剂 :称取高铁氰化钾[K 3 Fe(CN) 6 ]200mg、氰化钾(KCN)50mg、无水磷酸二氢钾140mg,Triton X-100 1.0ml,用蒸馏水溶解并稀释至1L。此试剂应呈透明、淡黄色,pH在7.0~7.4之间,以蒸馏水作空白,在540nm比色,读数也是0。此溶液应放置棕色试剂瓶中,塞紧后保存于冰箱中(但不宜冻结),至少可稳定数月。如发现试剂变绿、浑浊则不能使用。

[实验步骤]

1、在一 试管 中准确加入HiCN稀释试剂5.0ml,作为测定管。

2、用血红蛋白吸管准确吸取全血20u1,擦去管端血迹,置于试剂中,冲洗3次,混和。

3、将混合液放置3分钟以后,倒入光径1cm比色皿,用分光光度计在540nm进行比色。以 蒸馏 水或HiCN稀释试剂作空白管,校正光密度到0点,读取测定管光密度读数。

4、计算:

血红蛋白(g/L)= 测定管光密度×(64458/44000)×251

= 测定管光密度 × 367.7

式中:

(1)64458 是目前国际公认的血红蛋白分子量。

(2)44000 是国际血液学标准化委员会公布的血红蛋白摩尔吸光度。

(3)251是稀释倍数。

[方法评估]

HiCN法操作简便,试剂单一,除SHb外所有血红蛋白均可迅速转化为HiCN,显色快且稳定,可以根据吸光度直接计算结果,因此被列为国际血红蛋白测定的参考方法,也是我国推荐的首选方法,但其试剂中氰化钾为剧毒药品,须妥善保存、处理。另外,高球蛋白血症和白细胞明显增高的标本可导致反应液浑浊而影响结果。

[应用意义]

同改良沙利氏法。

[注意事项]

1、血红蛋白测定方法很多。但无论采用何种方法,都必须以HiCN法为标准,绘制标准曲线。

2、HiCN稀释液不能贮存在塑料瓶中,否则会使CNˉ丢失,测定结果偏低。HiCN稀释液应贮存在棕色有塞玻璃瓶中,4℃冰箱保存一般可用数月,但不能在0℃以下保存,因为结冰可引起高铁氰化钾还原,使溶液褪色失效。

3、氰化钾是剧毒品,配制稀释液时要按剧毒品管理程序操作。配制好的HiCN稀释液中因氰化钾含量低,又有高铁氰化钾存在,毒性不是很大。若进入体内,高铁氰化钾氧化血红蛋白,生成高铁血红蛋白。后者结合CNˉ,起到一定的解毒作用,但仍应妥善保管。

测定后的废液不能与酸性溶液混合,因为氰化钾遇酸可产生剧毒的氰氢酸气体。为防止氰化钾污染环境,比色测定后的废液集中于广口瓶中。应注意废液处理,可用除毒液除毒。

除毒方法为:取硫酸亚铁(FeSO 4 ·7H 2 O)二份加NaOH一份,在 研钵 中研细,配成100g/L的悬液。每1000ml废液加上述除毒液5ml,放置3小时,不时搅拌,使剧毒的氰化钾成为无毒的亚铁氰化钾。

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