蛋白质组学

如何判断一个蛋白是在转录水平起作用还是在翻译水平起作用?

最近在做荧光素酶双报告系统的实验,结果发现,用pcDNA3.1 overexpression我的目的蛋白后,随着目的蛋白剂量的增加,luciferase和Rellina的荧光值都有提高。由于该目的蛋白和许多mRNA的相关蛋白均有关系,因此我们推测该蛋白可能稳定了报告基因mRNA的寿命,导致其翻译水平的增加。

但是,也有可能它是在转录水平促进了启动子的非特异性转录导致报告基因的mRNA水平增加,因此,想请教各位大侠:如何判断一个蛋白是在转录水平还是翻译水平起作用?有没有什么相关的技术可以检测?或者有无类似文献可以参考?

非常感谢,请高手不吝赐教!

今天跟实验室朋友讨论了下,可以加入转录的抑制剂抑制报告基因的转录,然后再瞬时转染目的蛋白,随后做realtime RT-PCR检测对照组和加入目的蛋白组的mRNA水平的变化,如果增加了说明该目的蛋白在mRNA水平是有作用的;如果相对对照组没有提高,则说明该蛋白可能是在转录水平上发挥作用的,起码这个实验可以简单的划分一下转录和mRNA水平的调控情况。

不知列位对我这个想法有何高见,欢迎探讨!

按照你的意思,我理解为目的蛋白会调控报告基因的转录或者翻译是不?

说实话很抱歉,我对你跟贴讨论的实验方案有点看迷糊了的感觉。。。。。。。

在我看来,判断是转录还是翻译水平上的实验,就是看RNA或者protein水平有没有变化——我们先不讨论特殊情况——我只说如果是我首先会想到最普通最常见的情况。所以,我就会用northern blot来检测转录本水平,用western blot检测蛋白水平。我个人认为关键的是在对照组的选择,注意到你的目的蛋白是overexp.的,我认为至少有几组对照是必须的:

1)空载(不用说了);

2)没有目的基因但是含有完整报告系统的对照;

3)目的基因不Overexp的对照,

4)目的基因被抑制表达(无论是一直它的转录还是翻译,而不是像你跟贴论的那样,抑制报告基因的转录,因为这是你研究的对象,否则岂不是artificial manipulation?呵呵)

我们再转到你的问题上来,在我看来,区分是在翻译还是转录水平的调控并不是问题,问题是你已经有意识到问题:这种调控是直接的还是间接的,是特意的还是广泛的?这将是阐述可能存在的调控机制的核心问题之一。

最后我很希望大家能发表下看法,我个人认为这个实验很有趣。所以投一票给作者。

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师兄微信号:shixiongcoming

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