蛋白质组学

His-Tag原核表达――Qiagen

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分子诊断

近年来Qiagen公司无论在分子诊断方面,还是核酸、蛋白纯化方面都有出色的表现。在分子诊断这一块,根据Kalorama Information网站自2003年的统计,它作为分子诊断公司世界排名第九。在今年5月31号,它收购了artus公司,这是一家针对病原体、基因型和药物基因组学测试提供基于聚合酶连锁反应 (PCR)分子诊断公认的领导厂商,估计它作为分子诊断学公司的排名还将继续攀升。在核酸、蛋白纯化这方面,Qiagen分别在6月中旬和下旬收购了北京天为时代和Nextal生物科技公司,而Nextal是一家研究蛋白质晶体学的公司,他们拥有一套体系可以简化制备用于蛋白质晶体成像的蛋白的过程。它的加入为Qiagen在蛋白质研究这一块注入了新鲜的血液。

用基因工程的手段表达蛋白质,必需经过纯化才能实现最终目的。不同性质的蛋白质纯化条件各不相同太难摸索,这一点和核酸相差甚远,所以将目的蛋白和一个亲和纯化标签融合表达,通过亲和纯化Tag蛋白来纯化目的蛋白,就成为常用的迂回手段。大的Tag最后要经过切割得到目的蛋白,而His-Tag,这个只有6个组氨酸大小的标签在pH8.0时不带电,很小,几乎没有什么免疫原性,经多种融合蛋白验证对蛋白的分泌、折叠和结构,甚至功能几乎没影响,可以放在C端或者N端,更重要的是能够高度亲和Ni离子――而固化金属离子亲和层析已经相当成熟。所以融合蛋白纯化方便,HisTag得到越来越广泛应用。

Qiagen公司的原核表达产品设计的概念非常明确,所有表达载体都是围绕在纯化中应用最为广泛的组氨酸纯化标签设计的――因为Qiagen公司有纯化6×组氨酸而专门设计的专利产品氮川三乙酸镍(nickel-nitrilotriacetic acid,Ni-NTA)金属亲和层析填料。这种NTA填料独有4个金属螯合位点(而普通填料只有3个位点),能更牢固定Ni离子,避免其他同类填料容易在清洗过程中因固定不牢离子脱落而造成的产物回收率低等问题。也因为这个专利,Qiagen还替其他品牌代工生产Ni-NTA纯化填料。Qiagen公司的QIAexpress System纯化系统提供了许多优点是其它纯化系统无法比拟的。

特点

优势

6×组氨酸与Ni-NTA的结合是不受构象影响的 在天然或变形的条件下进行一步纯化
使用的是温和的洗脱液环境 结合、洗涤和洗脱步骤不会对蛋白结构产生影响
6×组氨酸标签比普通的标签(Tag)要小得多 纯化后蛋白可以直接进行下游操作
6×组氨酸可以用于任何表达系统,包括:细菌、杆装病毒和哺乳动物
6×组氨酸标签在生理溶液pH下不带电荷 标签不会干涉重组蛋白的结构和功能
6×组氨酸不会影响蛋白的分泌
6×组氨酸标签免疫原性差 重组蛋白可以不需要出去标签直接作为抗原进行免疫
利用Xa因子蛋白酶可以方便地将6×组氨酸标签有效地切除 去除标签的蛋白可以用作晶体成像或者核磁共振研究
一些QIAexpress载体带有6×组氨酸二氢叶酸还原酶标签(6×His-DHFR) 融合在6×组氨酸DHFT标签中的小肽段在表达时有助于保持稳定

6×组氨酸DHFR标签在小鼠和大鼠中的免疫原性不高,所以与之融合的重组蛋白不需要把标签切除,可以直接进行免疫或者表位测图

QIAexpress系列都是用pQE载体进行的,作为德国出品的东西,它具有德国人一贯的严谨性,各方面都考虑得比较周全。pQE载体都是以T5启动子起始转录-翻译系统的,pQE 是pDS家族的一员,来源于pDS56/RBSII和pDS781/RBSII-DHFRS。这些低拷贝质粒都有以下特征:

优化的启动子-操纵元模式,包括来自噬菌体的T5启动子(由大肠杆菌的RNA聚合酶识别)和两个乳糖操纵子识别序列,以保证与乳糖抑制子的结合从而抑制T5启动子的表达。

合成的核糖体结合位点RBSⅡ,保证高效的翻译

在克隆区域的5'或者3'含有6×组氨酸标签

有多个终止密码子,无论你的片段从多克隆位点的哪里插入都可以正确的终止。

两个强而有利的转录终止子:来自λ噬菌体的t0和来自大肠杆菌rrnB操纵元的T1,可以有效预防转录中的通读现象并保证表达质粒的稳定性。

所有质粒含有β- 内酰胺酶(bla)基因,因此氨苄霉素抗性,在t0和T1间插入有氯霉素乙酰化转移酶基因(chloramphenicol acetyl transferase gene,CAT),这个基因不带有启动子,通常不会被表达。根据菌株和载体的不同,会有少量的CAT活性被检测到。

ColE1复制起点

pQE-TriSytem不含有CAT盒(cassette)并利用pUC的复制起点,此载体含有三个启动子,可以分别在大肠杆菌、杆状病毒和哺乳动物中进行表达

Qiagen表达载体的分类可以根据加入的标签的种类、位置以及利用何种蛋白酶进行标签切割来分类。

在N末端加入标签

这一系列载体的N末端加有标签,其中pQE-30、pQE-9带有6×组氨酸标签,pQE30系列中的三个载体的多克隆位点距离其实密码子而个相差一个碱基,pQE-9则是在多克隆位点处的设计较简单。PQE40则是带有6×组氨酸二氢叶酸还原酶标签(6×His-DHFR),对于比较难表达的蛋白以及蛋白太小容易被降解的蛋白可以利用这种标签。它可以保证蛋白的稳定性,同时不会对外源蛋白的免疫原性造成很大的影响,非常适合用于表位筛选。

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