蛋白质组学

利用农杆菌侵染烟草进行体内瞬时表达的方法

一、原理

通常,我们可以利用烟草的瞬时表达系统来观察感兴趣蛋白的亚细胞定位(通过与绿色荧光蛋白构成融合蛋白)。同时,还可以检测蛋白的表达量。这一个过程是通过农杆菌作为一个工具将目的基因整合到到烟草的细胞内的。

二、材料与试剂

1. 携带表达载体的农杆菌菌株(通常表达载体由35S启动子驱动)

2. 2-4周的烟草植株

3. LB培养基

4. 乙酰丁香酮

5. 2-(N-吗啉代)乙磺酸

6. 抗生素

7. 注射器

三、仪器

1. 50 ml 离心管

2. 光谱仪

3. 紫外灯

4. 荧光显微镜

四、步骤

1. 挑取单克隆于5 ml LB液体培养中,28~30°C震荡培养。通常,LB中加入100 ug/ml 庆大霉素(农杆菌株GV3101携带抗性),50 ug/ml 大观霉素(载体携带)。

2. 将1 ml 过夜培养的农杆菌转接到25 ml LB液体培养基中(加有与1相同的抗生素,另外加入高压灭菌的乙酰丁香酮)。

3. 检测过夜培养的菌液OD600的值。

4. 5000 g,15分钟集菌,用重悬液重悬菌体,最终OD600为0.4。

5. 室温放置2~3 h后注射烟草。

6. 将侵染液装入5 ml 注射器内,用拇指按压注射器反板将液体从叶片下表皮注射到烟草叶片内(勿使用子叶)。注射后,烟草叶片会出现湿润的现象。

7. 注射后2~5天,在便携式长波长紫外灯下检测GFP荧光信号(只适用于荧光很强的叶片)。

8. 通过荧光显微镜或者激光共聚交荧光显微镜检测GFP信号。同时,可以提取蛋白,检测蛋白的含量。

五、配方

1. 加有相应抗生素的LB液体培养基(一种抗生素是菌株携带,一种为载体携带)。

2. 乙酰丁香酮(100 mM 溶于乙醇,-20°C储存)。

3. 1 M MgCl2

4. 重悬液(10 mM MgCl2,10 mM 2-(N-吗啉代)乙磺酸(pH5.6)高温高压灭菌15分钟,100 uM 乙酰丁香酮,高温高压灭菌)。

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