蛋白质组学

浅谈流式核内蛋白染色步骤

浅谈流式核内蛋白染色步骤:

1、染表面抗体 按说明书条件孵育全血样品孵育抗体后加入不含固定剂的溶血素(按厂家说明操作)溶血完毕。

2、用2ml预冷流式染色缓冲液(Flow Cytometry Staining Buffer)洗涤细胞300-400g离心5分钟,去上清。

3、用3倍体积的固定/破膜稀释液(#00-5223)稀释固定/破膜浓缩液(#00-5123)制成固定/破膜工作液,注意要新鲜配制,每个样本的用量为1ml 。

4、旋涡震荡重悬细胞后加入1ml的固定/破膜工作液(1:3稀释好)再次旋涡混匀,

避光4℃孵育30分钟到60分钟。

5、将破膜缓冲液(#00-8333)用去离子水1:9稀释,制成工作液(每个样本的用量为4~5ml)。

6、无需洗涤,直接加入2ml破膜缓冲液工作液(1:9稀释好)300-400g离心洗涤细胞并弃去上清液(可选)重复洗涤一次。

7、加入100 ul流式染色缓冲液重悬细胞体系中加入2 ul 胞内抗体来源的血清,室温避光孵育30分钟。

8、体系加入适量的核内(及胞浆)抗原抗体,对照管加入等量的同型对照,按说明书条件孵育。

9、加入2ml破膜缓冲液工作液离心洗涤细胞并弃去上清液(可选)重复洗涤一次。

10、用500ul 流式染色缓冲液重悬细胞,上机检测并分析,如不能立即检测,用0.5ml 0.1~4%多聚甲醛重悬,避光4℃保存24小时内上机分析。
相关产品信息:

品牌 目录号 产品名称 规格
ebioscience 00-5523-00 Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set Kit Kit
ebioscience 00-4222-26 Flow Cytometry Staining Buffer 600 mL
Jiamay 4222-261 Flow cytometry Staining buffer 125ml
Jiamay 4222-262 多聚甲醛溶液,4% 100mL
Jiamay 4222-263 FCM Lysing solution(Fixative Free) 10X 100T
Jiamay 4222-264 FCM Lysing solution(Fixative Free) 10X 250T
Jiamay 4222-265 FCM Lysing solution(Fixative Free) 10X 500T

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流式CBA多因子检测外包实验介绍

虽然液相蛋白定量检测的技术很多,但是大多数的技术仅能对样本进行单一指标的检测,同时检测多个指标时则需要提供大量的样本分批检测,操作繁琐,且各指标间差异性较大。对于样本量较少或需要对比各指标的用户,传统的技术无法满足需要。

日常实验中,常需对溶液体系中的可溶性蛋白进行定量检测,如细胞培养上清或血清中的细胞因子含量的定量分析,由于这些因子的含量较少,低于一般常规方法的检测下限,使用常规的蛋白检测方法Western Blot等很难检测。为此,著名的流式抗体公司BD-Pharmingen开发了基于流式细胞仪的液相蛋白定量技术——CBA。

CBA工作原理:Cytometric Bead Array(CBA),即细胞因子微球检测技术。是一种基于流式细胞检测系统的多重蛋白定量检测方法,它能够同时对单个样品中的多个指标进行检测。BD公司利用流式细胞仪可对荧光信号进行级数放大的特性,将受检的可溶性因子附着于一些具有近似细胞直径的微粒上,即可对受检样品中的各种可溶性因子进行检测。

CBA的基本原理近似于ELISA的检测,即利用微小、分散的颗粒捕获液体待测物,并利用流式细胞仪检测类似“三明治”的颗粒——待测物复合体所散发的荧光,从而测定待测物的数量。

流式CBA多因子检测外包实验

详细原理介绍:每个CBA微球大小一致,具有特定的荧光强度,包被有适用于特定分析(如其它抗体或者可溶性蛋白)的特异性捕获抗体(Capture Antibody),提供了类似ELISA孔板的捕获表面。当微球和待测样品溶液混合后,微球上的特异性抗体就与样品(血清、血浆或者细胞培养液)中相应的抗原或蛋白结合,然后加入荧光标记的检测抗体,就会形成“三明治”夹心复合物。最后通过流式细胞仪对特异性目的蛋白进行检测。

CBA的每种微球携带有不同强度的红色荧光,在流式细胞仪的FL3通道通过检测微球荧光强度的差异对目的蛋白定性;检测抗体带有PE荧光素标记,在流式细胞仪的FL2通道检测,通过检测抗体的PE荧光强度定量目的蛋白。

流式CBA多因子检测外包实验

CBA技术特点:CBA是集ELISA和细胞流式技术优点为一身的液相蛋白检测技术。CBA的每一种微球提供一种蛋白的捕获表面,捕获微球与待测样品后,呈悬浮态,与ELISA相比,能更有效地捕获被分析物;CBA具有FCM的宽范围荧光检测特点,对样本需求量更少,检测更快速、更准确。

下面我们介绍一下CBA主要的技术特点:
1、轻松实现多重检测。最多可同时对一个样本中的75个目的蛋白进行精确定量。

2、样本需要量小。仅需要50μL溶液就可进行一次检测。

3、更高的灵敏度。分析灵敏度高达2.8pg/mL。

4、更高的灵敏度、更宽的检测范围和更好的重复性。CBA技术使蛋白定量的分析灵敏度高达pg/ml级别,检测范围达0-5000pg/ml,所有分析只需一组标准曲线。根据抗体的荧光强度对目的蛋白定量,排除了ELISA反应中酶联放大产生的假阳性。

5、检测对象的灵活组合—BD CBA Flex Set。CBA kit是同时检测试剂盒配好的6个指标,形式比较固定。为满足不同客户的实际需要和研究兴趣,BD于2005年初推出了CBA Flexset。它改变了CBAkit的固定形式,成为自由组合、灵活搭配的“自助餐”。您可以根据需要组合不同的捕获微球来检测多个指标,最多能同时检测75个指标。除了拥有CBAkit的优势外,Flex Set还配有独立的软件分析系统(CBA Flex Set Analysis Software),并且可以在BDFACSArray Bioanalyzer上,直接用96孔和384孔板进行操作。CBA Flex set赋予研究者更灵活、更自由,更大的选择空间,而且进一步丰富了CBA产品线。种类涉及免疫、细胞信号传导、细胞凋亡等许多领域的蛋白定量分析。

6、操作简单,省时省力。CBA技术采用芯片式集成测定,所有检测只需一组标准曲线,就可计算出每种待测蛋白浓度;操作简单,整个流程只需要3.5小时,对待测样本可做实时分析,缩短检测了时间,提高了检测效率。

7、强大的软件分析系统。BD CBA软件具有强大的数据处理能力,直接将目标蛋白的检测结果换算成标准浓度;除了为用户提供待测物的计数结果外,还能提供可视轮廓或信号图形以帮助用户获得更多的信息。有用于Macintosh和Microsoft系统两种版本供您选择。和传统的液相蛋白定量技术相比,CBA技术是一种“多元”和“同步”的检测技术。革新的CBA技术与传统的蛋白定量相比有下列优点:

传统ELISA 流式CBA检测技术
单项检测 多参数检测
每项实验样本用量50-200ul 样本用量少于50ul
需要抗原包被 操作方便,节省时间
实验时间大于24h 流式细胞仪自动检测,标准曲线自动测定,专用软件自动计算
酶-底物背景干扰 无酶-底物背景干扰



流式CBA多因子检测外包实验

CBA应用:自CBA上市以来,越来越多的科研和临床研究人员将CBA应用于他们的领域。CBA应用领域涉及眼泪、血清、唾液、细胞培养上清等样本中细胞因子、炎症因子的水平的分析。CBA还用于细胞信号传导中磷酸化蛋白、凋亡相关蛋白分析,系统性红斑狼疮(SLE)和新生儿脓血症等免疫疾病的监控,肿瘤研究,药物对病人的治疗效果评估,药物研发,疫苗研究,总体免疫功能分析等多领域。

CBA指标检测明细:
1、CBA指标

目录号 产品说明 检测指标
557800 Non-human Primate Th1/Th2 Cytokine Kit IL-2, IL-4, IL-5, IL-6,TNF, IFN-γ
560485 Mouse Th1/Th2/Th17 Cytokine Kit IL-2, IL-4, IL-6, IFN-γ, TNF, IL-17A, IL-10
551287 Mouse Th1/Th2 Cytokine Kit IL-2, IL-4, IL-5, IFN-γ,TNF
552364 Mouse Inflammation Kit IL-6, IL-10, MCP-1, IFN-γ, TNF, IL-12p70
550026 Mouse Immunoglobulin Isotyping Kit Heavy and light chain isotypes of mouse IgG1,
IgG2a, IgG2b, IgG3, IgA, IgM, and IgE
560484 Human Th1/Th2/Th17 Kit IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, TNF, IFN-γ, IL-17A
550749 Human Th1/Th2 Cytokine Kit IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, TNF, IFN-g
551809 Human Th1/Th2 Cytokine Kit II IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, TNF, IFN-g
551811 Human Inflammatory Cytokine Kit IL-8, IL-1β, IL-6, IL-10, TNF, IL-12p70
552990 Human Chemokine Kit IL-8, RANTES, MIG, MCP-1, IP-10
561418 Human Anaphylatoxin Kit C3A,C4A,C5A

2、CBA Flex Set 细胞因子检测指标

Human Mouse Rat
IFN-γ,INF-α
IL-1 α ,IL-1β,
IL-2,IL-3,
IL-4 , IL-5, IL-6, IL-7,
IL-8, IL-9, IL-10,
IL-11,IL-12, IL-12p70,
IL-13,IL-17A, IL-21,
IL-23p40
TNF,TNFRⅠ,TNFRⅡ
IP-10
I-TAC
MIG
MCP-1
MIP-1 α, MIP-1 β
Eotaxin
RANTES
CD54(ICAM-1)
CD62E,CD62P,CD62L
CD106(VCAM-1)
sCD40
sCD154
sCD121a,sCD121b
Soluble CD14
Basic FGF
VEGF
Angiogenin
G-CSF,GM-CSF
LIF
LT-α
OSM
Granzyme A,
Granzyme B
Fas Ligand(FasL)
Fractalkine
IgA, IgG1, IgG2,
IgG3,IgG4, IgM,
Total IgG,
IFN- γ
IL-1 α ,IL-1β, IL-2,IL-3,
IL-4 , IL-5, IL-6, IL-9,
IL-10, IL-12, IL-12p70,
IL-13, IL-17A, IL-21,
IL-23p40,
TNF
MIG
MCP-1
MIP-1 α, MIP-1 β
RANTES
KC
CD62E(E-Selectin),
CD62L(L-Selectin)
G-CSF,GM-CSF
IFN- γ
IL-1 α, IL-4 , IL-6,
IL-10
TNF

3、CBA Flex Set 信号转导指标

Phospho Akt1(S473) Phospho Akt2(S474)
Phospho BLNK (Y84) Phospho p120 Catenin(Y228)
Phospho Btk (Y551) Phospho MEK1/2(S222)
Phospho eNOS (S1177) Phospho Paxillin(Y118)
Phospho ERK1/2 (T202/Y204) Phospho Pyk2(Y402)
Phospho Itk (Y511) Phospho SLP-76(Y145)
Phospho JNK1/2 (T183/Y185) Phospho c-jun(S63)
Phospho p38 (T180/Y182) Phospho stat3
Phospho PLCg (Y783) Total Stat1
Phospho Rsk (T573) Total Syk
Phospho Stat1 (Y701) Total ZAP70
Phospho Syk (Y352) Phospho ZAP70 (Y319)

4、CBA Flex Set 干细胞指标

Human Rex-1 Flex Set Human Nanog Flex Set
Human Oct-4 Flex Set

嘉美实验期待着在流式CBA的检测中与您合作。更多的实验、技术及产品的咨询,请联系嘉美生物!

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