蛋白质组学

SDS-PAGE疑难及常见问题分析

积层胶(或称浓缩胶)的作用原理?
在缓冲系统中的弱酸,如甘氨酸,在pH6.7时很少解离,其有效泳动速率很低,而氯离子却有很高的泳动速率,蛋白质的泳动速率介于两者之间。加上电 压以后,作为先导离子的氯离子和尾随离子的甘氨酸离子分离开来,并在其后面留下一个导电性较低的区带。由于导电性和电场强度成反比,这一区带便获得较高的 电压梯度,加速甘氨酸离子的泳动,使其赶上氯离子,建立起甘氨酸和氯离子的电压梯度和泳动速率乘积相等的稳定态(我不太明白这句话),使这些带电颗粒以相 同的速度泳动,两种离子之间有明显的边界。当甘氨酸、氯离子界面通过样品进入浓缩胶时,在移动界面前有一低电压梯度,界面后有一高电压梯度。由于在移动界 面前的蛋白质分子泳动速率比氯离子低,因此氯离子能迅速越过。移动界面后的蛋白质处于较高的电压梯度中,其泳动速率比甘氨酸快。因此,移动的界面将蛋白质 分子堆积到一起,形成一条狭窄的区带。蛋白质在移动界面中的浓度作用仅取决于样品和浓缩胶中Tris-HCl的浓度(为什么?),而与样品中蛋白质的最初 浓度无关。由于浓缩胶为大孔凝胶,故对蛋白样品没有分子筛作用。当移动的界面到达浓缩胶和分离胶的界面时,凝胶的pH明显增加,导致甘氨酸大量解离。此 时,甘氨酸的有效泳动速率明显增加,超越蛋白分子,直接在氯离子后移动。由于凝胶孔径变小,蛋白质分子的迁移速率降低,落在后面的蛋白质便在均一的电压梯 度和pH环境中泳动,并根据其固有的电荷与分子大小进行分离。
1. 配胶缓冲液系统对电泳的影响?

在SDS-PAGE不连续电泳中,制胶缓冲液使用的是Tris-HCL缓冲系统,浓缩胶是pH6.7,分离胶pH8.9;而电泳缓冲液使用的Tris-甘氨酸缓冲系统。在浓缩胶中,其pH环境呈弱酸性,因此甘氨酸解离很少,其在电场的作用下,泳动效率低;而CL离子却很高,两者之间形成导电性较低的区带,蛋白分子就介于二者之间泳动。由于导电性与电场强度成反比,这一区带便形成了较高的电压剃度,压着蛋白质分子聚集到一起,浓缩为一狭窄的区带。当样品进入分离胶后,由于胶中pH的增加,呈碱性,甘氨酸大量解离,泳动速率增加,直接紧随氯离子之后,同时由于分离胶孔径的缩小,在电场的作用下,蛋白分子根据其固有的带电性和分子大小进行分离。

 所以,pH对整个反应体系的影响是至关重要的,实验中在排除其他因素之后仍不能很好解决问题的情况,应首要考虑该因素。

2. 样品如何处理?

  根据样品分离目的不同,主要有三种处理方法:还原SDS处理、非还原SDS处理、带有烷基化作用的还原SDS处理。

1)还原SDS处理:在上样buffer中加入SDS和DTT(或Beta巯基乙醇)后,蛋白质构象被解离,电荷被中和,形成SDS与蛋白相结合的分子,在电泳中,只根据分子量来分离。一般电泳均按这种方式处理,样品稀释适当浓度,加入上样Buffer,离心,沸水煮5min,再离心加样。

2)带有烷基化作用的还原SDS处理:碘乙酸胺的烷基化作用可以很好的并经久牢固的保护SH基团,得到较窄的谱带;另碘乙酸胺可捕集过量的DTT,而防止银染时的纹理现象。100ul样品缓冲液中10ul 20%的碘乙酸胺,并在室温保温30min。

3)非还原SDS处理:生理体液、血清、尿素等样品,一般只用1%SDS沸水中煮3min,未加还原剂,因而蛋白折叠未被破坏,不可作为测定分子量来使用。

3. SDS-PAGE电泳凝胶中各主要成分的作用?

 聚丙烯酰胺的作用:丙烯酰胺与为蛋白质电泳提供载体,其凝固的好坏直接关系到电泳成功与否,与促凝剂及环境密切相关;

制胶缓冲液:浓缩胶选择pH6.7,分离胶选择pH8.9,选择tris-HCL系统,

  TEMED与AP:AP提供自由基,TEMED是催化剂,催化自由基引起的聚合反应进行;  十二烷基硫酸钠(SDS):阳离子去污剂,作用有四:去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋白分子内的疏水作用、去多肽折叠。

4. 提高SDS-PAGE电泳分辨率的途径?

 聚丙烯酰胺的充分聚合,可提高凝胶的分辨率。建议做法:待凝胶在室温凝固后,可在室温下放置一段时间使用。忌即配即用或4度冰箱放置,前者易导致凝固不充分,后者可导致SDS结晶。一般凝胶可在室温下保存4天,SDS可水解聚丙烯酰胺。

  一般常用的有氨基黑、考马斯亮蓝、银染色三种染料,不同染料又各自不同的染色方法,具体可参照郭尧君编著的《蛋白质电泳技术手册》P82-103。

5.“ 微笑”(两边翘起中间凹下)形带原因?

  主要是由于凝胶的中间部分凝固不均匀所致,多出现于较厚的凝胶中。

处理办法:待其充分凝固再作后续实验。

6. “皱眉”(两边向下中间鼓起)形带原因?

  主要出现在蛋白质垂直电泳槽中,一般是两板之间的底部间隙气泡未排除干净。

处理办法:可在两板间加入适量缓冲液,以排除气泡。  S1 R) b( |8 L

7. 为什么带出现拖尾现象?

 主要是样品融解效果不佳或分离胶浓度过大引起的。" h) R3 l6 |" P! }

处理办法:加样前离心;选择适当的样品缓冲液,加适量样品促溶剂;电泳缓冲液时间过长,重新配制;降低凝胶浓度。(

8. 为什么带出现纹理现象?

  主要是样品不溶性颗粒引起的。

处理办法:加样前离心;加适量样品促溶剂。

9. 什么是“鬼带”,如何处理?

 “鬼带”就是在跑大分子构象复杂的蛋白质分子时,常会出现在泳道顶端(有时在浓缩胶中)的一些大分子未知条带或加样孔底部有沉淀,主要由于还原剂在加热的过程中被氧化而失去活性,致使原来被解离的蛋白质分子重新折叠结合和亚基重新缔合,聚合成大分子,其分子量要比目标条带大,有时不能进入分离胶。但它却于目标条带有相同的免疫学活性,在WB反应中可见其能与目标条带对应的抗体作用。8 N/ p5 D( B, Y9 M, u* |* Z

处理办法:在加热煮沸后,再添加适量的DTT或Beta巯基乙醇,以补充不足的还原剂;或可加适量EDTA来阻止还原剂的氧化。

10. 为什么溴酚蓝不能起到指示作用?

 我们在实验中常会遇到溴酚蓝已跑出板底,但蛋白质却还未跑下来的现象。主要与缓冲液和分离胶的浓度有关。

处理办法:更换正确pH值的Buffer;降低分离胶的浓度。

1. 为什么电泳的条带很粗?

 电泳中条带很粗是常见的事,主要是未浓缩好的原因。

处理办法:适当增加浓缩胶的长度;保证浓缩胶贮液的pH正确(6.7);适当降低电压;

2. 为什么电泳电压很高而电流却很低呢?

 这种现象一般初学者易出现。比如电压50v以上,可电流却在5mA以下。主要是由于电泳槽没有正确装配,电流未形成通路。包括:a.内外槽装反;b.外槽液过少;c.电泳槽底部的绝缘体未去掉(比如倒胶用的橡胶皮)。) g9 p/ P& r" S1 [$ u. u. E

处理办法:电泳槽正确装配即可。、

3. 浓缩胶与分离胶断裂、板间有气泡对电泳有影响吗?

 这主要出现在初学者中,一般对电泳不会有太大的影响。前者主要原因是拔梳子用力不均匀或过猛所致;后者是由于在解除制胶的夹子后,板未压紧而致空气进入引起的。"

14. 凝胶时间不对,或慢或快,怎么回事?

通常胶在30MIN-1H内凝。如果凝的太慢,可能是TEMED,APS剂量不够或者失效。APS应该现配现用,TEMED不稳定,易被氧化成黄色。如果凝的太快,可能是APS和TEMED用量过多,此时胶太硬易裂,电泳时易烧胶。

15. 电泳时间比正常要长?

  可能由于凝胶缓冲系统和电级缓冲系统地PH选择错误,即缓冲系统地PH和被分离物质的等电点差别太小,或缓冲系统的离子强度太高。
(责任编辑:大汉昆仑王)

(0)

热评文章

发表评论